加载中…加载中…加载中…加载中…加载中…这一从培养的单层哺乳动物细胞中分离ＲＮＡ的实验程序系为Ｆavaloro 等（1980）所介绍程序的改良。该程序同样适用于从悬浮培养的哺乳动物细胞中或从易于分散成单个细胞的哺乳动物组织中分离ＲＮＡ。但不适用于从固体组织中提取ＲＮＡ，因为用这种裂解细胞的方法（在ＳＤＳ存在的条件下用蛋白酶Ｋ消化）去消化组织速度很慢，导致内源性ＲＮＡ酶在被蛋白酶Ｋ消化或被抑制剂灭活前有时间发挥作用。原方案中（Ｆavaloro等。1980）采用的裂解缓冲液含有0.015 ％（W/V）的Ｍacaloid（硅藻土），用于吸附并灭活ＲＮＡ酶。尽管现仍有Ｍacaloid出售ＮＬＣhemicals）， 但氧钒核糖核苷复合物和ＲＮＡ酶的蛋白质抑制剂更常用。下述程序的优点是速度快，并能同时处理很多样品。
一、细胞的裂解
a．单层细胞的裂解
a）吸出培养液，以７ml用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液ＰＢＳ冲洗细胞培养皿内的单层细胞，重复１次，将平板置于冰上直至所有单层细胞冲洗完毕。也可将平板放在一块铝板上，再将铝板置于冰盘上。
b）直径为90mm的培养皿需加0.5ml ＲＮＡ提取缓冲液， 并使之遍布整个平板的表面。
| 分类： 核酸技术 |
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基因组DNA提取方法 |
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1， |
| 分类： 我的记录 |
3.1
ODN是指化学合成的、按正常磷酸二酯键连接的DNA片段。美国Zamecnik实验室早在1978年就报道利用人工合成的与劳氏肉瘤病毒（RSV）的m_RNA的5′_和3′_端重复序列互补的β聚核苷酸，能抑制该病毒增殖，使培养的鸡胚细胞不被转化为癌细胞。他们还合成了一些DNA片段以观察对艾滋病毒（HIV）的抑制作用：其中12聚、20聚和26聚脱氧核苷酸序列是与病毒mRNA的某些易于进攻的区域互补的。结果发现20聚片段对逆转录酶有67％抑制，对其表达产物P15和P24蛋白分别有95％和88％抑制。裘慕绥等报道反义ODN对小鼠腹水瘤病毒（SRSV）这种逆转录病毒有抑制作用，用互补于病毒RNA基因5′端引物tRNA区的15聚ODN，可使病毒感染宿主细胞生长抑制90％。许毅等针对人胃癌基因（c_Ha_ras 基因）合成了2个15聚ODN，一个是与c_H
| 分类： 我的记录 |
2.1
目前，许多癌基因和病毒基因的序列已经弄清。因此，只要对其mRNA序列选择一个区段设计所要合成的反义DNA/RNA序列。这些区段主要包括：5′端帽结构区；mRNA的起始编码区或编码区；核前体mRNA的拼接区；反转录病毒的引物区等。这些区段均为基因表达的关键区或敏感区，对基因的调控可起“四两拨千斤”的作用。一般而言，只要人工设计合成12个以上碱基序列的反义DNA或反义RNA（即反义寡脱氧核苷酸或反义寡核苷酸），就足以使此反义核酸与靶mRNA形成结合作用，且这种结合调节是非常特异性的。
2.2
反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASON)或反义寡脱氧核苷酸(antisense
oligodeoxynucletide,ASODN)的功能在很大程度上取决于其稳定性，ASON或ASODN在体内生理条件下，很容易被各种核酸酶降解，这样就根本无法达到阻遏mRNA翻译的目的。因此，人们对反义核酸的结构进行各种化学修饰以
| 分类： 我的记录 |
| 分类： 常用免疫学实验 |
溶血空斑形成试验
撰稿 杨 琨
溶血空斑形成试验是一种体外检测单个抗体形成细胞(浆细胞)的方法，故又称体外抗体形成细胞(Plaque Forming
Cell,
PFC)测定技术。此项技术不仅可以作为免疫基本理论研究的有力工具，广泛地用于检测产生IgM类型(包括其它各类免疫球蛋白及其亚类)的抗体形成细胞，它还可作为临床筛选抗肿瘤新药以及研究中药对抗体免疫功能影响的免疫学指标。
一、原理：
溶血空斑形成试验的基本原理是将经绵羊红细胞免疫小鼠的脾细胞与一定量的绵羊红细胞混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围那些受到抗体分子致敏的绵羊红细胞溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。根据所操作的方法不同可分为直接溶血空斑试验，间接溶血空斑试验，琼脂固相法，小室液相法，单细胞层法等等。下面介绍直接溶血空斑形成试验。
二、操作步骤：
1. 底层琼脂平皿的制备：将1.4％琼脂加热融化后倾注于平皿内，每个平皿6ml，凝固后置湿盒37℃备用。
2. 0.7％琼脂加热融化后加入华氏管内，每
| 分类： 细胞培养技术 |
第二节
一、细胞复苏的原则
| 分类： 细胞培养技术 |
第一节
| 分类： 细胞培养技术 |
***药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶，Hanks液。
***仪器：C02培养箱，倒置：显微镜，超净台。
1．人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。
2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。
3．超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭溶液擦净。
4．打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。
5．点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。
6．将培养用液瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架
| 分类： 常用免疫学实验 |
细胞因子〔Cytokines；CKs）是指由活化的免疫细胞（包括淋巴细胞和非淋巴细胞）和某些基质细胞分泌的、介导和调节免疫应答及炎症反应的小分子多肽类因子，它们是除免疫球蛋白和补体之外的另一类非特异性免疫效应物质。细胞因子包括由淋巴细胞产生的淋巴因子（lymphokine）和由单核巨噬细胞产生的单核因子（monokine）等。近10年来，由于基因工程和细胞工程的迅猛发展，相继发现了许多新的细胞因子，并证实它们是机体复杂的免疫细胞间相互作用和调节的物质基础，从而使人们从分子水平上去认识细胞因子网络的形成在机体免疫调节中的重要作用，这将有助于对临床某些疾病的诊断和防治提供有用的手段。
一、发展历史和命名
1966年发现第一个由淋巴细胞分泌的非免疫球蛋白的免疫活性因子--巨噬细胞移动抑制因子，以后又陆续发现了许多淋巴细胞来源的活性因子，1969年提出了“淋巴因子”的概念。此后，又发现了许多非淋巴细胞如单核／巨噬细胞、纤维母细胞、大颗粒淋巴细胞、内皮细胞、上皮细胞以及各种转化细胞系等分泌的活性因子，因而提出了“单核因子”的概念。由于如此众多的免疫活性因子的发现，且鉴于对其本质尚不清楚，因而均以其生物学活性命名，致使这
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