转自中国病毒学自由学术论坛

    报告基因必须具备的特点：①由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别；②细胞内其他基因产物不会于扰报告基因产物的检测；③报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高，而且重现性好。到目前为止，报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连，先让质粒在大肠杆菌中进行增殖，再提取质粒，转染人感兴趣的真核细胞中。与此同时还要将有真核启动子和增强子的另一种报告基因质粒共转染同一细胞，作为转染率的内对照。
    (1)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)：该报告基因来源于大肠杆菌转位子9，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。CAT在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。可用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定(enzyme—linkedimmunosorbantassay，ELISA)检测其活性，也可进行蛋白质印迹(Westernblotting)和免疫组织化学分析。CAT与其他报告基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。
&nb

     转自：中国生命科学论坛病毒学版

      杆状病毒是一类寄生于节肢动物的杆状的病原微生物。其宿主主要是鳞翅目、膜翅目和双翅目的昆虫, 还有一些杆状病毒可以感染甲壳纲的节肢生物。杆状病毒常常包埋于由蛋白质组成的包含体基质(polyhedron/granulin)中。根据包含体的形态和病原微生物在(昆虫)细胞中的分布, 可以将杆状病毒划分为核多角体病毒属(NPV)和颗粒体病毒属(GV)两个属。其中核多角体病毒属又根据病毒粒子包膜中的粒子数目不同而划分为多粒包埋型核多角体病毒(MNPV)和单粒包埋型核多角体病毒(SNPV),杆状病毒在其生活史中具有两种形态, 出芽病毒粒子BV(budded virus)和包埋型病毒粒子ODV(occlusion derived virus)。ODV 被包埋于由多角体蛋白质组成的包含体中, 包含体的外侧还有多角体囊膜。多角体在环境中非常稳定, 能对病毒粒子起到保护作用。当多角体被昆虫幼虫吞食后, 在虫体中肠的偏碱性环境中能迅速溶解释放出病毒粒子, 病毒粒子便由中肠开始感染虫体。ODV 对于杆状病毒在环境中的传播起重要作用。BV 使病毒感染细胞的早期形成的出芽病毒, 它在从细胞膜上出芽时获得了一种病毒编码的囊膜蛋白,

    Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。

Cre重组酶和LoxP序列

Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。

LoxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP

转自：http://blog.bioon.com/user1/4455/archives/2007/133856.shtml

      生物谷博客

    新病毒的起源和病毒的起源是两个不同的概念，新病毒都是由旧有病毒经过突变与进化而产生。基因突变是病毒变种的根本原因，突变也是病毒适应环境谋求生存的重要方式，突变是遗传进化的基础。病毒作为一种独立的生物群体,其进化也必然符合达尔文的自然选择学说(natural selection theory) 。病毒为更好地生存、更好地适应环境,

   转自：中国生命科学论坛 病毒学版

   噬菌体展示技术（Phage Displaytechniques，PDT）起源于1985年, 美国Missouri大学的Smith GP首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程手段改造,他把EcoRⅠ内切酶的部分基因片段与丝状噬菌体的次要衣壳蛋白pⅢ(proteinⅢ) 基因融合,获得的重组噬菌体能被抗EcoRⅠ内切酶的抗体所识别,由此建立了噬菌体展示技术(phage displaytechnolog -y) 。噬菌体展示技术能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面,进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体 ,为筛选到目的蛋白或多肽奠定了基础

    overlap PCR:重叠PCR的应用是非常广泛的，他的原理其实很简单：比如说有两个基因或者说一个启动子和一个基因，你要将他们连接到一起，我们首先想到的方法当然是借助于酶切的方法，但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶非常特殊或者又很贵，我们可能只用一次，这样购买酶就变成了一种浪费，难道没有别的办法了吗？当然有，那就是重组PCR技术。举个例子可能更容易说明。比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。

A的序列为5-atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3，

B的序列为5-atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。

首先我们要设计引物，假设引物的序列为：
A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3
A2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3
B1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3
B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3
    我们的目的是将基因A,B通过PCR的方法连接起来，我们可以仔细的观察上面的引物A2和B1，我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多，为什么会这样呢？这就是我们在设计引物的时候在A2的3端

Kozak sequence

    KOZAK是一个女科学家，她研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子两端序列为：——G/N-C/N-C/N-ANNATGG——，如GCCACCATGG、GCCATGATGG时，转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。
    在真核起始过程中，由Met-tRNAi，eIF-2和GTP形成了三元复合体（ternary complex）再结合40S小亚基形成前起始复合物(preinitiation complex)。此复合物的形成分为二步：首先GTP和eIF-2结合，以增加此因子与Met-tRNA．结合的效率。然后三元复合体再与40S亚基结合。核糖体结合位点由起始密码子所决定，在某些起始密码子上游邻接序列也可能十分重要，被称为Kozak序

1.磷酸钙共沉淀
    将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。

2.电穿孔法
    电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。

3.DEAE-葡聚糖和polybrene
    带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时

一. 提高胶回收量的办法：
1) 增加电泳时的上样量。
2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。
3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。
4) 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。
5) 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。
6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30％异丙醇在加热溶解胶后的液体里。
7) 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟（大约需10分钟），以使乙醇充分挥发。
8) 最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱（不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱）；洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。