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GATK使用(一)

(2013-01-18 09:05:42)
标签:

gatk

分类: Bioinformatics
  首先说说GATK可以做什么。它主要用于从sequencing 数据中进行variant calling,包括SNP、INDEL。比如现在风行的exome sequencing找variant,一般通过BWA+GATK的pipeline进行数据分析。
 run GATK,首先得了解它的网站(http://www.broadinstitute.org/gatk/)。

一.准备工作
(1)程序下载
http://www.broadinstitute.org/gatk/download
务必下载最新版,注意不是那个GATK-lite,而是GATK2.(目前是2,不知何时会更新到3.更新很快啊有木有,所以一定要用新版)解压到某个目录即可,无需安装。打开解压缩后的目录,会发现GenomeAnalysisTK.jar这个文件。我们要用的各种工具都在这个包里。
(2)Reference sequence和annotation下载
务必使用GATK resource bundle上各种序列和注释来run GATK。 
GATK resource bundle介绍:
http://gatkforums.broadinstitute.org/discussion/1213/whats-in-the-resource-bundle-and-how-can-i-get-it
GATK resource bundle FTP地址:
http://gatkforums.broadinstitute.org/discussion/1215/how-can-i-access-the-gsa-public-ftp-server
例如呢,以hg19(human genome build 19.此外,b37也很常用)为参考序列,
输入如下命令: lftp ftp.broadinstitute.org -u gsapubftp-anonymous
回车后键入空格,便可进入resource bundle。进入其中名为bundle的目录,找到最新版的hg19目录。
要下载的文件包括:
ucsc.hg19.fasta
ucsc.hg19.fasta.fai
1000G_omni2.5.hg19.vcf
1000G_omni2.5.hg19.vcf.idx
1000G_phase1.indels.hg19.vcf
1000G_phase1.indels.hg19.vcf.idx
dbsnp_137.hg19.vcf
dbsnp_137.hg19.vcf.idx
hapmap_3.3.hg19.vcf
hapmap_3.3.hg19.vcf.idx
Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf
Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf.idx
(3)R 设置
GATK某些步骤需要使用R画一些图,此时会调用一些R packages。如果你使用的R没有装这些packages,就无法生成pdf文件。因此得安装一些必要的R packages,包括(但不限于)如下:
  • bitops
  • caTools
  • colorspace
  • gdata
  • ggplot2
  • gplots
  • gtools
  • RColorBrewer
  • reshape
  • gsalib
如何check这些packages有没有安装?以ggplot2为例,进入R,输入library(ggplot2),如果没有error信息,就表明安装了ggplot2;如果没有安装,输入命令install.packages("ggplot2"),按照提示操作便可安装ggplot2。如果package安装不成功,很可能是权限问题:默认使用的R是系统管理员安装的,而你在/usr等目录下没有write权限。这是可以选择直接在自己目录下安装了R,然后install各种packages。也可以在 install.packages时指定将packages安装到自己的目录。

将R packages安装到自己目录的方法:
 install.packages("ggplot2", lib="/your/own/R-packages/")
然后将指定的路径添加到R_LIBS变量即可。

gsalib的安装有点不一样。
从该网站下载gsalib:https://github.com/broadgsa/gatk
解压缩后,进入build.xml文件所在的目录,输入命令ant gsalib。这样就可以安装gsalib 了。如果该gsalib仍然无法load,可能需要将gsllib的path告诉R。
http://gatkforums.broadinstitute.org/discussion/1244/what-is-a-gatkreport
这里有较详细的步骤。(奇怪的是我没有~/.Rprofle文件,ant完后也没有add path,仍然work了)
此外,gaslib安装要求java的版本为1.6。

设置路径:
export R_HOME=/your/R/install/path
export R_LIBS=/your/R-packages/path

如何查看当前使用的R的路径?输入 which R即可。


二.流程概览
GATK使用(一)
图片摘自http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices。话说这个Best practices,刚开始接触GATK时每个人都推荐我看,可是我就是看不懂...许多东西要亲自做过后,再回头看才能懂。不过既然那么元老级人物都说要看看,所以如果你是新手,还是看看吧。

好消息是现在该页面多了个BroadE Workshop的东东,里面的一些材料非常有用。http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/events?id=2038#materials
在工作之前,最好把这些work materials通览一遍。

seqanswers上的这个wiki也是很好的入门材料,可以让你看看每一步在做什么。
http://seqanswers.com/wiki/How-to/exome_analysis
但是呢,它比较过时了,它使用的GATK版本应该是2.0以前的,现在的流程有了一些调整,一些参数设置也有变化。所以该pipeline仅供参考,切勿照抄代码。例如它关于reference sequence的那一部分,是自己手动generate hg19的genome sequence。但是,由于后面要用到dbSNP和indel的各种annotation,而这些file的index很可能和自己generate的hg19的index不一样(resource bundle上hg19除了chr1-22,X,Y,chrC,ChrM外还会多出一些没有组装的序列),这样会导致程序出错,到时候还得重头来过。所以,务必使用GATK resource bundle上的东西!
我后面贴出的代码也一样,切勿照抄。鬼知道过几个月GATK又会有什么变化。It keeps changing all the time...时刻跟上GATK网站上的update才是王道。(虽然它的网站做得...实在算不上好...好多时候我都找不到自己想要的东西)

三.流程
(1)Mapping。
因我只处理过Miseq和Hiseq的pair-end数据,以此为例。Mapping多使用BWA,因为它能允许indels。另一常用mapping软件Bowtie则不能generate indels,多用于perfect match的场合如sRNA mapping。
首先建立reference的index。
bwa index -a bwtsw -p hg19 hg19.fasta
这个过程耗时良久...above 5h吧。
-p是给reference起的名字。完成后会生成如下几个文件:
 hg19.amb
 hg19.ann
 hg19.bwt
 hg19.dict
 hg19.pac
 hg19.sa
然后是mapping喽,开始贴代码...先对pair-end数据的pair1和pair2分别进行mapping,生成相应的sai file,然后再结合两者生成sam file。接着利用picard对sam file进行sort,并且生成sort后的bam file。
sample=$1
data_dir=***
work_dir=*** 
ref_dir=~/database/hg19
sai_dir=$work_dir/saifiles
sam_dir=$work_dir/samfiles
bam_dir=$work_dir/bamfiles
log_dir=$work_dir/logs
met_dir=$work_dir/metrics
other_dir=$work_dir/otherfiles
gatk=/software/sequencing/GenomeAnalysisTK-2.3-4-g57ea19f/GenomeAnalysisTK.jar
picard=/software/sequencing/picard_latest

bwa aln $ref_dir/hg19 -t 4 $data_dir/${sample}_1.fastq.gz > $sai_dir/${sample}_1.sai

bwa aln $ref_dir/hg19 -t 4 $data_dir/${sample}_2.fastq.gz > $sai_dir/${sample}_2.sai

bwa sampe -r "@RG\tID:$sample\tLB:$sample\tSM:$sample\tPL:ILLUMINA"   $ref_dir/hg19 $sai_dir/${sample}_1.sai $sai_dir/${sample}_2.sai $data_dir/${sample}_1.fastq.gz $data_dir/${sample}_2.fastq.gz | gzip > $sam_dir/$sample.sam.gz

java -Xmx10g -Djava.io.tmpdir=/tmp \
 -jar $picard/SortSam.jar \
 INPUT=$sam_dir/$sample.sam.gz \
 OUTPUT=$bam_dir/$sample.bam \
 SORT_ORDER=coordinate\
 VALIDATION_STRINGENCY=LENIENT \
 CREATE_INDEX=true

Tips:
a. bwa以及后面使用的一系列tools都能直接读取gzip压缩文件。为了节省硬盘空间,以及减少压缩/解压缩过程的read/write时间,最好直接用*.gz文件作为input。output也最好先在管道里使用gzip压缩一下再输出。
b.bwa sample一步里的-r选项不可忽略。
c.Picard的SortSam需指定一个tmp目录,用于存放中间文件,中间文件会很大,above 10G.注意指定目录的空间大小。
d.对于压缩后大小约3G的fastq.gz文件,bwa aln需run 30-60min。将生成的两个sai file merge到一起生成sam file需60-90min。利用picard sort sam需30-60min。
e.Samtools也提供了工具进行sam file的sort和bam file的生成,并且不会生成大的中间文件。

(2) Duplicate marking。
这一步的目的是mark那些PCR的duplicate。由于PCR有biases,有的序列在会被overpresented, 它们有着相同的序列和一致的map位置,对GATK的work会造成影响。这一步给这些序列设置一个flag以标志它们,方便GATK的识别。还可以设置 REMOVE_DUPLICATES=true 来丢弃duplicated序列,不过还未探索过只标记不丢弃和丢弃对于后续分析的影响。官方流程里只用标记就好。
java -Xmx15g
-Djava.io.tmpdir=/tmp \
 -jar $picard/MarkDuplicates.jar \
 INPUT= $bam_dir/$sample.bam \
OUTPUT= $bam_dir/$sample.dedupped.bam \
 METRICS_FILE= $met_dir/$sample.dedupped.metrics \
 CREATE_INDEX=true \
VALIDATION_STRINGENCY=LENIENT

(3)Local relignment
INDEL附近的alignment通常不准,需要利用已知的indel信息进行realignment,分两步,第一步进行 RealignerTargetCreator,输出一个包含着possible indels的文件。第一步IndelRealigner,利用此文件进行realign。
第一步需要用到一些已知的indel信息。那么该使用哪些文件呢?
参考如下的链接:http://gatkforums.broadinstitute.org/discussion/1247/what-should-i-use-as-known-variantssites-for-running-tool-x 
其中这张图表尤其有用,可以看到RealignerTargetCreatorIndelRealigner步骤中推荐使用两个indel注释file,如代码中-known所示。

Tool dbSNP 129 - dbSNP >132 - Mills indels - 1KG indels - HapMap - Omni
RealignerTargetCreator X X
IndelRealigner X X
BaseRecalibrator X X X
(UnifiedGenotyper/ HaplotypeCaller) X
VariantRecalibrator X X X X
VariantEval X
java -Xmx15g -jar $gatk \
-T RealignerTargetCreator \
-R $ref_dir/hg19.fasta \
-o $other_dir/$sample.realigner.intervals \
-I $bam_dir/$sample.dedupped.bam \
-known $ref_dir/1000G_phase1.indels.hg19.vcf \
-known $ref_dir/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf

java -Xmx15g -jar $gatk \
-T IndelRealigner \
 -R $ref_dir/hg19.fasta \
 -I $bam_dir/$sample.dedupped.bam \
-targetIntervals $other_dir/$sample.realigner.intervals \
 -o $bam_dir/$sample.dedupped.realigned.bam \
-known $ref_dir/1000G_phase1.indels.hg19.vcf \
-known $ref_dir/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf
在一些老版本的pipeline中(如seqanswers上的那个),这一步做完后还要对pair-end数据的mate information进行fix。不过新版本已经不需要这一步了,Indel realign可以自己fix mate。参考http://gatkforums.broadinstitute.org/discussion/1562/need-to-run-a-step-with-fixmateinformation-after-realignment-step

(4) Base quality score recalibration
这一步简称BQSR,对base的quality score进行校正。同样要用到一些SNP和indel的已知文件(参考上表和代码中-known选项)。第一步BaseRecalibrator生成一个用于校正的recal.grp文件和一个校正前的plot;第一步BaseRecalibrator生成一个校正后的plot;第三步PringReads利用recal.grp进行校正,输出校正后的bam file。
java -Xmx15g -jar $gatk \
 -T BaseRecalibrator \
 -R $ref_dir/hg19.fasta \
 -I $bam_dir/$sample.dedupped.realigned.bam \
 -knownSites $ref_dir/dbsnp_137.hg19.vcf \
 -knownSites $ref_dir/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf \
 -knownSites $ref_dir/1000G_phase1.indels.hg19.vcf \
 -o $other_dir/$sample.recal.grp \
 -plots $other_dir/$sample.recal.grp.pdf

java -Xmx15g -jar $gatk \
 -T BaseRecalibrator \
 -R $ref_dir/hg19.fasta \
 -I $bam_dir/$sample.dedupped.realigned.bam \
 -BQSR $other_dir/$sample.recal.grp \
 -o $other_dir/$sample.post_recal.grp \
 -plots $other_dir/$sample.post_recal.grp.pdf \
 -knownSites $ref_dir/dbsnp_137.hg19.vcf \
 -knownSites $ref_dir/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf \
 -knownSites $ref_dir/1000G_phase1.indels.hg19.vcf

java -Xmx15g -jar $gatk \
 -T PrintReads \
 -R $ref_dir/hg19.fasta \
 -I $bam_dir/$sample.dedupped.realigned.bam \
 -BQSR $other_dir/$sample.recal.grp \
 -o $bam_dir/$sample.dedupped.realigned.recal.bam
TIPS:
这一步里如果产生不了PDF文件,很可能是Rscript的执行出了问题。检查R里面是否安装了该安装的packages。如果仍无法找出原因,可以在BaseRecalibrator那两步加上-l DEBUG再运行,此时的log信息中会详细写明为什么Rscript执行不了。

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