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转:膜蛋白分离的方法和原理-蛋白提取

(2011-02-24 16:49:22)
标签:

膜蛋白

溶解

抽提

提取

蛋白质

杂谈

分类: 技术交流
 1、分离膜蛋白的方法(原则性):

    1) 先分离膜,然后提取;如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎,然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。(例如:michael11液氮研磨组织,加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收集37%与41%间的成分,即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白 )

    2 )用特殊的去污剂选择性的分离。 从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下,都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来,然后将蛋白质稳定.去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定,但在某些情况下,还要考虑到以后的纯化步骤.虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化,但最终仍可能需要除去去垢剂.这常常会引起蛋白质失活,但如果蛋白质是用于测序的,他将不是一个问题.如果不是用于测序的,可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中,都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而,他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时,必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如 triton X-100在280nm处有吸收,如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关,就应避免使用这类去垢剂.

    将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后,再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白,而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白,无论在种类上还是数量上,都比酸溶解法所得到的蛋白(<5000Da)要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足0.1%,所以充分的膜蛋白的提取,无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的. 第二种方法简单,可靠,但有时含有其他蛋白。一般的都是利用4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液,在温度超过20度时,此溶液分为水相和去污相;此时亲水性蛋白溶于水相,疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。

    3 )膜蛋白色谱(Chromatography of Membrane Protein,CMP)CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统,一般有去垢剂(如SDS)溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白,并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团(P-端),又具有阳离子钙(C-端),与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现,样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换,从而达到分级分离的目的。

   4) 顺序抽提法:根据细胞蛋白溶解性的差异,用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白;把未溶解的pellet用标准液溶解提取高疏水性蛋白;最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液,最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。

   5)centrifugal protein extraction

原理:高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后,超高速离心

评价:尽管分级(胞浆和胞膜)之间有清洗的步骤,但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点.该方法相较MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上发表的分级抽提法减去了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(极难溶蛋白),在操作上也作了简化,总而言之是一种不错的方法。(codegreen)

   6)detergent- based:提取时先裂解液裂胞膜(选用不同的去污试剂是关键),梯度离心分离细胞器(ER),然后分级抽提方法。例如,去掉细胞器之后的DEBRIS就是核膜,再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部分。

   总的感受:细胞的量要很充足。之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白,方便迅速。

   到目前为止,提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈。

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