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物理农业:土壤微生物检测方法

(2009-07-09 18:51:42)
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土壤

微生物

连作

测定方法

电处理

物理农业

分类: 温室设备与技术

    物理农业中的核心技术之一“土壤连作障碍电处理机”依赖的基础研究内容涉及到土壤微生物、根结线虫、氧化还原电位等的检测,其实验室检测与实际生产的取样检测相结合,并采取动态监测方式,测定土壤微生物的发展动态和优势种群,进而确定最佳的电处理的程序。

物理农业:土壤微生物检测方法

五角星花

 

土壤微生物计数法

    土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库,所含微生物不仅数量巨大,而且各类繁多,主要包括细菌、真菌和放线菌三大类,是土壤最活跃的成分。土壤微生物数量测定方法可分为三大类:一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量,统称为培养计数法,主要有稀释平板法和最大或然计数法;二类是将土壤微生物染色后,在显微镜下观察计数,称为直接镜检法,包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等;三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定,主要有离心分离法。

1.1培养计数法

1.1.1概要

在自然条件下,土壤中的大多数微生物处于休眠状态,一旦供给可利用的碳源(如培养基),一些微生物将快速生长繁殖。因此,根据在培养基上所生长的微生物数量,可以估算土壤中微生物的数量。这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法,主要包括稀释平板计数法(简称稀释平板法)和最大或然计数法。

稀释平板计数法的基本原理:土壤微生物经分散处理成为单个细胞后,在特殊的培养基上生长并形成一个菌落,根据形成的菌落数来计算微生物的数量。

最大或然计数法的基本原理:假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布,并在试管或平板上全部存活,随着稀释倍数的加大,稀释液中微生物的数量将越来越少,直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后,没有或很少出现微生物菌落。根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度,再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。

1.1.2稀释平板法

一、试剂配制

常用的培养基各类很多(见附录一),可根据需要测定的微生物种类选择培养基。按配方配制培养基后,先在121℃下灭菌15min,冷却至45~50℃使用。凝固后的培养基可加热溶解后使用。

二、仪器设备

广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞,移液管(1ml、10ml,吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌)培养皿(9㎝,用牛皮纸包好后灭菌)和显微镜等。

三、操作步骤

(1)土壤系列稀释液制备

取新鲜土壤(<2㎜)10.00g,放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中,塞上经灭菌的橡皮塞,在振荡机上振荡10min,此为10-1土壤稀释液。迅速用灭菌的移液管吸取10-1土壤稀释液10ml,放入灭菌的装有90ml水的广口瓶中,塞上橡皮塞,混合均匀,此为10-2土壤稀释液。再如此依次配制10-3、10-4、10-5和10-6系列土壤稀释液。上述操作均在无菌条件下进行,以避免污染。

(2)平板制备和培养

从两个稀释倍数的土壤稀释液中(细菌和放线菌通常用10-5和10-6土壤稀释液,真菌用10-2和10-3稀释液)吸取1.00ml(吸前摇匀),分别放入五套培养皿中(注意每变换一次浓度,须更换一支移液管);再向培养皿内注入45~50℃的培养基10ml,立即混合均匀,静置凝固后,倒置放于培养箱中培养。细菌和放线菌在28℃下培养7~10d,真菌在25℃下培养3~5d。

(3)镜检计数

尽管使用不同的培养基,但细菌、放线菌和真菌都可能在同一个培养基上生长,所以必须用显微镜做进一步的观察。明显有菌丝的一般是真菌,真菌的菌丝为丝状分枝,比较粗大;而放线菌菌丝呈放射状,比较细。细菌有球状和杆状,有些细菌也形成细小的菌丝。酵母菌的菌落与细菌的菌落很相似,但在显微镜下容易分辨。酵母菌个体比较大,一般有圆形、椭圆形、卵形、柠檬形或黄瓜形,有些还有瘤状的芽。

在两级稀释度中,选细菌和放线菌的菌落数为30~200个、真菌菌落数为20~40个的培养皿各5个,取其平均值计算出每组的菌落数。如果菌落很多,可将其分成2~4等份进行计数。微生物生物量可以通过微生物细胞个体大小和密度计算得到。

(4)计算

土壤微生物数量(cfu·g-1)=MD/W

式中M为菌落平均数:D为稀释倍数;W为土壤烘干质量(g)。

1.1.3最大或然计数法(MPN)

一、试剂配制

培养基配制与稀释平板法基本相同,采用试管培养时,培养基中不需加琼脂。

二、食品设备

试管(2㎝×18㎝),其他同稀释平板法。

三、操作步骤

(1)土壤系列稀释液中制备

按稀释平板法制备土壤系列稀释液,一般配制10-1~10-6的稀释液。

(2)接种和培养

从上述土壤系列稀释液中各取1ml接种到平板培养基或试管液体培养基中,每个稀释度重复3~5次,同时设置空白对照,以检验是否被污染。因微生物类型和生长速度不同,所要求的稀释倍数、培养基和培养时间都有差别(表1-1)。根据微生物类型分别在28~30℃培养7~30d。培养结束时,记录出现菌落的平板数量或出现特征反应的试管数。

表1-1  几种主要土壤微生物生理群MPN计数方法

物理农业:土壤微生物检测方法 

(3)计算

通常将有微生物生长的最后3个稀释度中出现微生物菌落的平板数作为微生物生长指标,从最大或然数表中查出最大或然数近似值,按下列公式计算样品中的微生物数量:

土壤微生物数量(cfu·g-1)=MD/W

式中M为最大或然数近似值;D为全部出现菌落的最高稀释倍数;W为土壤烘干质量(g)。

例如,某土壤系列稀释液1ml接种到5个平板,经培养后,10-3~10-5的稀释液全部出现菌落;接种10-6稀释液的5个平板只有4个出现菌落;接种10-7稀释液的只有1个出现菌落;接种10-8稀释液的全部没有菌落。由此得到土壤的微生物生长指标为541,查最大或然数表(见附录三,表三)得到其最大或然数近似值为17,乘以第一位数的稀释倍数105,再除以土壤烘干质量即可得到土壤微生物数量。

微生物生长的数量指标都应当是三位数。但是不管重复数多少,第一位数字如重复数相等,即代表全部重复都出现菌落的最高稀释倍数的数值。后两位数字依次是以下两个稀释度出现菌落的平板数量。如果以下稀释液还出现了微生物菌落,则将其出现微生物菌落的重复数加到第三位数上。例如,10-3~10-8系列稀释液(4个重复)出现菌落的平板数分别为4,4,3,2,1和0.这里10-7稀释液出现菌落的平板数为1,将其加到前一稀释液(10-6)的平板数上,即得该土壤的微生物生长指标为433,查表得最大或然数近似值为30,计算得到每克土壤(新鲜重)的微生物数量为3.0×105

应注意:如果出现微生物生长的稀释度比没有出现微生物生长的稀释倍数低,则说明微生物在稀释液中不是均匀分布的,在这种情况下就需要对实验方案进行核查。

1.1.4方法评论

最初研究土壤微生物的方法是培养计数法,该方法的优点在于可测定土壤中可培养的、不同类型的微生物数量,包括细菌、真菌和放线菌,特别是可用于测定可培养的、具有特殊功能的微生物种群,如氨化细菌、硝化细菌、反硝化细菌、解磷菌和固氮菌等。该方法存在的问题是,仅能测定在培养基上迅速生长繁殖,并能够形成菌落或有某种特征的土壤微生物种群,而大部分土壤微生物种群不能在培养基上生长。另外,在培养基上所形成的菌落可能来自多个细胞,也有可能由菌丝(或多个细胞)发育成菌落。因此,培养计数法所测定的微生物数量,通常不到土壤中微生物实际数量的1%,故不能作为土壤微生物的真实数量。此外,该方法即使用于测定土壤中可培养的微生物数量,测定结果的精确度和重复性较差。

1.2直接镜检计数法

1.2.1概要

由于土壤微生物的特性和培养基的局限性,通过在培养基上生长的菌落数量来间接地计算土壤微生物数量,一般只能测量出土壤中很少的一部分微生物。因此,一些研究者提出了直接镜检计数法,主要包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法。使用一般的染色剂进行涂片染色,镜检时很难区别死的微生物细胞和土壤颗粒,这里仅介绍FDA染色涂片测定活菌丝数和FITC染色测定活细菌数的方法。

涂片法的基本原理:将一定量的土壤悬浮液涂抹在载玻片上,风干染色后进行镜检计数,从而计算出单位质量土壤的微生物数量。由于使用特别的染色剂可着色活细胞,从而可测定土壤活体微生物数量。

琼脂薄片法的基本原理:在制备土壤悬浮液时加入一定量琼脂,在进行土壤分散的同时进行加热,取一定量的土壤-琼脂悬浮液制成琼脂薄片,染色后进行镜检计数,再计算出单位质量土壤的微生物数量。

膜过滤的基本原理:将土壤悬浮液用无菌水稀释,取一定量的稀释液染色后,用微孔膜过滤,对微孔膜上的微生物进行镜检计数,再计算出单位质量土壤的微生物数量。

1.2.2 FDA染色涂片法测定活菌丝数

一、试剂配制

磷酸盐缓冲液(0.06mol·L-1):8.28 g  溶于1L去离子水,10.68g  溶于1L去离子水;将两种溶液按28﹕72的比例混合,调节pH值使其与土壤pH值大致相同。

FDA染色液:见附录二

琼脂溶液(1.5%):1.5g琼脂溶于100ml磷酸盐缓冲液中(pH7.6)。

二、仪器设备

三角瓶(200ml),试管(15ml),振荡机,载玻片(图1-1),盖玻片,荧光显微镜等。

物理农业:土壤微生物检测方法 

图1-1 染色-镜检法涂片

外圆面积1cm2,半径5.64㎜,内圆半径3.64㎜,镜检必须在外圆边缘约1.7㎜以内的区域进行

三、操作步骤

(1)土壤分散

取10.00g新鲜土壤(2㎜)于200ml三角瓶中,加入95 ml 0.06 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液,充分振荡15 min。

(2)染色

取1 ml 土壤悬浮液于15 ml的试管中,加入4 ml 磷酸盐缓冲溶液,再加入1 ml FDA染色液。室温下培养3 min 后,加入1 ml 琼脂溶液,混匀。

(3)涂片和镜检

取0.1 ml 上述土壤-染色液-琼脂混合液均匀地涂于如图1-1所求的载玻片上,盖上盖玻片,迅速用荧光显微镜进行镜检计数。镜检计数方法见下文的琼脂薄片法。

(4)计算

土壤活菌丝的生物体积及生物量碳计算方法同琼脂薄片法。

1.2.3  FITC染色涂片法测定活细菌数

一、试剂配制

Tris-盐酸溶液I :6.35 g 三羟基氨基甲烷溶于800 ml 去离子水,用浓盐酸调节pH值至7.5,定溶至 1 L。

Tris-盐酸溶液II :25.4 g 三羟基氨基甲烷溶于800 ml 去离子水,用浓盐酸调节pH值至7.5,定溶至 1 L。

INT溶液:2 g 氯化2-(p-碘苯基-3-p-硝基苯 )-5-苯四氮唑溶于1 L Tris-盐酸溶液II中。

NADH-NADPH混合溶液:0.4 g NADH和0.4 g NADPH溶于100 ml Tris-盐酸溶液II中。

FITC染色液:见附录二

碳酸盐-重碳酸盐缓冲液(0.5 mol·L-1):42 g 溶于1 L去离子水;53 g 溶于1 L 去离子水。吸取80 ml 和100 ml 溶液混合,加去离子水500 ml并调节pH值至9.6,定容至1 L。

焦磷酸钠溶液(5%, ):8.39 g 焦磷酸钠( )溶于100 ml去离子水。

碳酸钠溶液 :10.6 g 碳酸钠溶于100 ml去离子水。

甘油溶液:量取45 ml 甘油于5 ml 1 mol·L-1碳酸钠溶液中,摇匀。

磷酸盐缓冲液(0.01 mol·L-1,pH 7.2):1.38 g 溶于1 L去离子水中,1.78 g 溶于1 L去离子水,将两种溶液按28﹕72的比例混合。

氯化钠溶液 :8.77 g 氯化钠溶于1 L去离子水。

甲醛溶液:20 ml 甲醛溶于80 ml去离子水。

二、仪器设备

烧杯(100 ml),搅拌机,闪烁计数瓶,超声波水浴器,载玻片(图1-1),盖玻片,荧光显微镜等。

三、操作步骤

(1)土壤分散

取1.00 g 新鲜土壤(<2㎜)于100 ml烧杯中,加入20 ml Tris-盐酸溶液I,用搅拌机低速搅拌1 min。

(2)培养

取2.0 ml上述土壤悬浮液于闪烁计数瓶中,加入1 ml INT溶液,再加入1 ml NADHNADPH混合溶液,在25℃的黑暗条件下培养4 h。再加入1 ml 20%甲醛水溶液,4℃过夜。

(3)涂片和染色

将上述装有经培养的土壤悬浮液的闪烁计数瓶置于超声波水溶器中,低能量(输出功率50W)超声波处理2 min,加入琼脂使其浓度达到0.01%( V/V)。取0.01 ml混合液均匀地涂沫于如图1-1所示的载玻片上(使用前用稀酸洗涤),于酒精灯上加热干燥后用FITC染色液染色3 min。染色后置于0.5 mol·L-1碳酸盐-重碳酸盐缓冲液中浸泡10 min,再转入5%焦磷酸钠溶液中浸泡2 min,取出用去离子水轻轻冲洗。

(4)镜检

洗涤后染色片干燥后,加一滴甘油溶液,盖上盖玻片固定,用荧光显微镜进行镜进行镜检计数,具体方法参见琼脂薄片法。

(5)计算

土壤活细菌的生物体积和生物量碳的计算方法参见琼脂薄片法。

1.2.4琼脂薄片法

一、试剂配制

琼脂-Decon 90溶液:1g琼脂溶于100ml无菌水(过0.20um滤膜),加热溶解,再与20ml Decon 90稀释液(12ml Decon 90于100ml无菌水)混合均匀。

台酚蓝溶液:5g 苯酚溶于100 ml无菌水,1g台酚蓝溶于100 ml无菌水;按照15﹕1的比例混合;再按4﹕1与冰醋酸混合,用0.2um膜过滤。

二、仪器设备

可控温超声波水浴清洗机(300 Ultrasonik NEY),可调慢速搅拌机(1.5V,0~2000rev·min-1,Kanke and Kunkel EKA-labortechnik),显微镜,显相器(Camera lucida),血球计数板(图1-2),盖玻片(厚0.47㎜),加拿大香脂(Canada Balsam)。

物理农业:土壤微生物检测方法

图1-2   血球计数板(改进型)

三、操作步骤

(1)土壤分散

取1.00~2.00g(根据土壤微生物含量而定)<2㎜的新鲜土壤于100 ml塑料杯中,加入60 ml 60℃的琼脂-Decon 90混合溶液。将塑料杯置于超声波清洗机水槽中(土壤琼脂混合溶液的液面要低于水面),最大功率处理15 min。在超声波处理过程中,保持水浴60℃,并不断慢速搅拌土壤琼脂悬浮液。处理结束后仍继续搅拌土壤悬浮液,直到取样前30 s停止。取样必须在10 min内完成。

(2)琼脂薄片制备

将吸管(内径1㎜)插入土壤-琼脂悬浮液液面下1㎝处,吸取约0.02 ml悬浮液,迅速放入血球计数板上,立即盖上盖玻片(厚0.47㎜),冷却凝固后一起放入去离子水(用前经0.2 滤膜过滤)中,使琼脂薄片分离。每个样品至少做4个琼脂薄片,即4次重复。

(3)染色

将琼脂薄片放到普通玻片上,干燥后浸泡在台酚蓝溶液中。1h后先用无菌水冲洗,再用95%酒精脱水。在琼脂薄片上加一滴加拿大香脂,盖上普通的盖玻片,即得琼脂薄片,可永久保存。

(4)镜检

将琼脂薄片置于显微镜下,在目镜上放入New Porton G12分格计数板,根据表1-2进行镜检。仅对被染为深蓝色的球形和圆柱形微生物计数,形状不规则(如破裂开)和其他颜色(如黄色、紫红色)的物体均不计数。

球形微生物分为11级(表1-2),直径在0.34~0.97 的为第1组,计数面积为2.0×102 (相应于New Porton G12分格玻璃片左上角的两个方格)。直径在0.97~3.13 的为第2组,计数面积为2.1×103 (相应于New Porton G12分格玻璃片的全部方格),第1组和第2组在油镜下镜检。直径在3.13~16.00 的为第3组,在500倍下镜检,计数面积为3.7×104 (相应于目镜分格玻璃片的A方格面积)。圆柱形微生物可分为8级,均在500倍下进行镜检,计数面积同球形微生物的第3组。圆柱形微生物的直径用New Porton G12分格玻璃片直接测量,而长度则通过显相器直接描绘在A4纸上,再用测绘轮测定其长度,也可用其他的方法如网格交叉的方法来测定。每一组必须在不同部位镜检20次。如果20次所测定的微生物个数低于40,则必须加测20次。

表1-2  直接显微镜检的视野和放大倍数

物理农业:土壤微生物检测方法

(5)计算

根据镜检所测定的微生物数量及所计数的面积计算微生物生物体积,再按其密度(1.1g· )、干物质含量(25%)和含碳量(47%)估计微生物生物量碳。

例如0.49~0.69 球形微生物在20次镜检中的结果为20,镜检总面积为4.0×103 (20×2.0×102),则可计算得到被镜检(琼脂薄片厚度为0.1㎜)的土壤质量(Ms)为6.7×10-6g(1/60×镜检总面积×10-6×0.1㎜);单位土壤(g)该球形微生物数量(N=20/Ms)为2.98×106 cfu·g-1;其生物总体积V(0.1×N×10-9)为2.98×10-4(mm3·g-1)。故可按下式计算该球形微生物的生物量碳(Bc;0.424 ):

Bc=V×1.1×0.25×0.47×103(μg·g-1

1.2.5膜过滤法

一、试剂配制

Decon90溶液:取12 ml浓溶液于100 ml经0.2  滤膜过滤的水中。

NaCl溶液 :8.77 g NaCl溶于1L去离子水,0.2 滤膜过滤。

柠檬酸钠系列缓冲溶液( ):21.01 g  溶于1 L去离子水,53.61g  溶于1 L去离子水;吸取13.6 ml、21.6 ml和30.7 ml柠檬酸溶液分别与36.4 ml、28.4 ml和19.3 ml磷酸钠溶液混合,即配制成pH值为6.6,5.5和4.0的柠檬酸盐系列缓冲溶液,制备的溶液均经0.2 滤膜过滤。

甲醛,Cargille油。

二、仪器设备

微孔滤膜(孔径分别为8 、3 、0.8 、0.45 ,膜直径25㎜)和过滤装置。

三、操作步骤

(1)土壤分散

取1.00~2.00 g(根据土壤微生物数量而定)<2㎜的新鲜土壤于100 ml塑料杯中,加入50 ml无菌水和10 ml Decon 90溶液,在5℃下用超声波清洗机处理15 min,同时慢速搅拌,将土壤悬浮液用无菌水稀释到200~500倍。

(2)细菌的过滤、染色及镜检

土壤稀释液摇匀后静置5 min,吸取一定量(根据土壤微生物数量而定,一般50 ml),用孔径为8 的微孔膜过滤,以除去土壤颗粒、有机物质和菌丝等。再吸取一定量的过滤液,用孔径为3 的微孔膜过滤。取1.9 ml滤液,加入0.1 ml甲醛,甲醛的最终浓度为2%,再加入0.2 ml AO溶液,黑暗中室温培养10 min。吸取0.25 ml于过滤器上,加入8.0 ml NaCl溶液,用0.45 的微孔膜(黑底)抽滤。再依次用pH值6.6,5.5和4.0的柠檬酸钠缓冲溶液及去离子水洗涤,将滤膜转移到载玻片上,在膜的底部和上部各放一滴Cargille油,盖上盖玻片,用荧光显微镜进行镜检计数,至少重复4次。

(3)真菌的过滤、染色及镜检

适当稀释的土壤悬浮液摇匀后静止30s,用移液管从容量瓶的中部吸取1.00 ml土壤悬浮液,放到已加入5 ml无菌水的膜过滤器中。再加入三滴吕氏美蓝溶液,用无菌水将总体积调节到约15 ml。混合30s后进行抽滤,用无菌水冲洗过滤器壁部2~3次。移下微孔膜(0.8 ,白底),风干后置于载玻片上,在滤膜上下各加一滴Cargille油,盖上盖玻片,同上在普通显微镜下进行镜检。每个样品至少做4次重复。

土壤颗粒和有机物质也会被染成蓝色,但形状不规则或者成团,只有被染成蓝色,并具有规则形状的菌丝才计数。

(4)计算

细菌和真菌的生物体积及生物量碳计算参见琼脂薄片法。

1.2.6方法评价与应用

土壤中的微生物大多数附着在土壤颗粒表面,测定时必须使微生物与土壤颗粒分离,所采用的方法包括物理方法和化学方法。前者包括研磨、振荡、高速搅拌或超声波处理等;后者加入分散剂使土壤团聚体分散,常用的分散剂有六偏磷酸钠缓冲溶液、NaCl、离子交换树脂、Decon、胆酸钠。在实际应用中,通常在物理处理的同时加入分散剂,以增加土壤分散效果。

最初是采用研磨方法将微生物与土壤颗粒分散开,Babiuk和Paul改进用高速搅拌机分散,Jenkinson等人比较了研磨、高速搅拌以及后来提出的超声波处理三种方法,结果表明超声波处理分散效果最好;他们还发现加入洗涤剂能加强分散效果,并使琼脂薄片比较清晰而容易观察。林启美对超声波处理时间进行了研究,发现处理15 min时获得的微生物生物量最大,时间太短不能将微生物与土壤颗粒分散,太长则会破碎微生物细胞,二者都会降低测定结果。他还比较了6种土壤分散处理方法,发现各处理方法所测定的结果之间没有显著性的差异,但使用洗涤剂的琼脂薄片比较干净,易于镜检。尽管超声波处理加分散剂的分散效果最好,但是镜检仍然发现有一些细菌团,一些菌丝附着在土壤颗粒尤其是有机残体上,从而难以计数。可见,对于分散方法仍需进一步研究和改进。

染色对琼脂薄片镜检有很大的影响,多种染色方法曾被使用,常用的有吖啶橙、棉蓝、苯胺蓝、台酚蓝、二苯基脒基靛酚、荧光素异硫氰酸盐、荧光素二乙酸盐、Eu(TTA)3等。

不同的染色剂与细胞成分的亲和力不同,有的着色细胞质,有的则着色细胞核。一种染色剂很难使所有的填充微生物着色,并且常常同时使土壤颗粒、腐殖物质和死亡的微生物细胞也着色,导致镜检比较困难。Jones和Mollison发现苯胺蓝能使土壤中的大多数微生物呈现蓝颜色,并且着色的细胞几乎都是活细胞。但也有少量菌丝呈黄色或紫红色,这部分菌丝的数量不到被染成蓝色的菌丝的5%,Jenkinson等人将这部分菌丝视为死亡菌,不进行计数。由于在分散过程中可能将菌丝撕裂,显微镜下常常见到不规则形状的碎片,也不被计数,仅计数被染成蓝色的并且有规则形状(球形和圆柱形)的微生物。林启美比较了苯胺蓝和台酚蓝,发现用台酚蓝能够使更多的菌丝染色。吖啶橙与DNA、RNA、酸性多糖等细胞成分亲和力较强,因此曾被广泛用作活菌体染色。荧光素异硫氰酸盐与蛋白质的亲和力很强,但不能使真菌着色。FDA常用于测定活菌丝数量。Eu(TTA)3能够使活细胞的核酸着色。荧光增亮素对根际微生物尤其是3~10 大小的微生物有很好的染色效果,但也能使死细胞和有机物质着色。

一般认为荧光染色仅能使活细胞着色,而土壤矿质颗粒和腐殖物质不会着色,从而能够测定出活体微生物数量,并且易于镜检。但荧光染色常常具有专一性,并且荧光停留时间也比较短,从而限制了镜检计数时间。因此,应根据研究需要选择适当的染色剂。

镜检时一般根据微生物的形态,将其分为球形和圆柱状两组,并对每组进行分级,在不同的放大倍数下镜检。土壤中绝大多数细菌单个细胞的直径为0.5~2.0 。林启美将直径为0.4~3.13 的球形微生物视为细菌,而大于3.13 球形微生物视为真菌胞子,所有圆柱形微生物都视为真菌菌丝。据此可测定出细菌和真菌的生物量,与采用选择性呼吸抑制方法所得的结果十分接近。

放大倍数对镜检的结果影响较大,高倍下能测到更多的菌丝,Frankland指出相差显微镜比普通显微镜能够检测出更多的菌丝,Lundgren发现对细菌进行分组比镜检单个细胞获得的细菌数量多25%。

直接镜检计数方法是直接利用显微镜进行观察计数,理论上应该能够测定出土壤微生物总数,反映土壤微生物的现状。但由于受土壤矿物、有机质、染色方法等的干扰和影响,直接镜检计数方法也不能非常准确地测定土壤微生物的总数,而且所测定的微生物主要是生长比较缓慢的微生物类群。另外,直接镜检方法影响因素较多,尤其是在镜检时对菌体的分辨和判断,在很大程度上依赖经验,且费时费力,作为常规土壤微生物细胞分布不均匀,不能准确计量所用的土壤质量以及微生物数量,因而测定结果的精确度比较低。有人采用将已知浓度的色素微粒悬浮液与土壤悬浮按照一定的比例混合,根据色素颗粒与微生物细胞的比例计算所用的悬浮液的土壤质量。尽管这样对测定结果的精确度有所提高,但也不可能准确地测定出土壤微生物总量。

Jenkinson等人采用琼脂薄片法测定土壤微生物总数,并将其换算为生物量,发现与熏蒸培养法所测定的值相吻合。Vance等人也得到类似的结果。Lin和Brookes对该方法进行了改进,所测定的土壤微生物生物量与用熏蒸提取法测到的结果具有极显著的相关性。

微孔膜过滤可用于测定土壤真菌菌丝长度,并且较为简单快速,林启美报道微孔膜过滤方法与琼脂薄片直接镜检法所测定的菌丝量非常接近。近几年已开发出能够自动计数的计算机软件,使镜检计数自动化,但仍有一些问题有待解决。

1.3多步离心分离法

1.3.1概要

土壤微生物一般与土壤颗粒结合,包藏在土壤团聚体内。Faegri等人提出用多步低速离心方法从土壤中分离细菌和真菌,基本操作步骤如图1-4。由于采用多步离心分离法提取土壤真菌较为困难,这是介绍Vilarino等人提出的土壤菌丝提取方法。

 

物理农业:土壤微生物检测方法

 

离心分离法提取土壤细菌的原理:新鲜土壤经多次不同分散处理和低速离心,收集所有上清液,纯化后即得提取的土壤细菌。

Vilarino等人提取土壤真菌的原理:新鲜土壤经分散后,土壤悬浮液中的菌丝可附着在慢速转动的铜丝框上,洗脱后即得提取的土壤真菌。

1.3.2土壤细菌分离

一、试剂配制

胆酸钠溶液(0.1%, ):0.1g胆酸钠( )溶于100 ml去离子水。

钠离子交换树脂:螯合离子交换树脂与 溶液中和,再用去离子水反复洗涤至pH值为7.0。

梯度离心介质:5 ml Percoll加入蔗糖0.43(密度≤ )。

Tris缓冲液( ):0.97 g 三羟基氨基甲烷和6.61 g 三羟基氨基甲烷盐酸溶于1 L去离子水。

Tris-盐缓冲液( :24.22 g 三羟基氨基甲烷溶于1 L 0.8% NaCl溶液,用稀盐酸调节至pH7.0.

二、仪器设备

低速离心机,高速离心机,Waring搅拌机,聚碳酸酯离心管,超声波水浴器,振荡机等。

三、操作步骤

(1)土壤分散和离心

土壤分散和离心操作步骤如图1-5所示。

物理农业:土壤微生物检测方法

图1-5  离心法提取土壤细菌程序 

(2)纯化

将上述收集的所有上清液混合,用滤布(<30 )过滤,以除去有机物碎片和矿物质颗粒。滤液用Tris-盐缓冲液在10 000g 下离心15 min,去掉清液。沉降物中加入20 ml Tris-盐缓冲液,用Waring搅拌机混合均匀。吸取4 ml放入到聚碳酸酯离心管中,将Percoll注入到离心管的底部,10 000 g 离心15 min。用蠕动泵抽出细菌浓缩液,用Tris-盐缓冲溶液(1﹕20)洗涤Percoll沉淀物4~6次(10 000g离心15 min)。纯化的细菌可用于各种分析。

1.3.3 土壤真菌分离

一、试剂配制

Ringer溶液:6 g NaCl,0.1 g KCl和0.1 g CaCl2溶于1 L去离子水。

二、仪器设备

离心机,提取菌丝的装置(图1-6),离心管。

三、操作步骤

(1)土壤分散和离心

取10g新鲜土壤(<2㎜)于100 ml离心管中,加入75 ml Ringer溶液。手摇30 s 后,在2200 g 下离心5 min,除去上清液。

(2)过滤

沉淀物用大约150 ml的Ringer溶液洗涤过滤(<100 )至200 ml烧杯中,以除去土壤颗粒和植物根系。

(3)提取

过滤液采用如图1-6所示的菌丝提取装置在慢速转动下进行提取,每个样液提取5次,每次4 min。附着在提取装置铜丝上的菌丝用Ringer溶液洗脱到0.45 滤膜上,烘干后称重或用于其他分析。

1.3.4方法评价与应用

多步离心分离法既要使微生物与土壤颗粒分离,又要保证基本不破坏微生物细胞。所Faegril等人的研究,在离心力为300 g 时多次离心能使大部分细菌进入上清液,但真菌则与填充颗粒一起沉降。Hopkins等人采用500g离心,Bakken采用630~1060g,Rits等人建议采用小于100 g。现有的离心分离方法对外标细菌的回收率可以达到90%。土壤处理的方法也很多,包括搅拌、匀浆、超声波、振荡等,使用的化学分散剂有Tween 80、Triton X-100、月桂酰肌氨酸钠、胆酸钠、离子交换树脂等。Bakken比较了3种搅拌方法和5种分散剂的效果,发现Waring搅拌机比较合适,水和其他分散剂的处理效果一样,同时指出分离效果受土壤性质尤其是有机质和黏粒含量的影响很大。Macdonald指出胆酸钠+离子交换树脂的分离效果较好,Hopkins等人采用10种方法处理,也发现胆酸钠+钠离子交换树脂分散土壤的效果最好。

为了避免土壤黏粒和有机物质对分离细菌的干扰,Macdonald用30 的滤布去掉胞子、菌丝及根系,再用淘洗的方法将细菌从土壤悬浮液中分离出来。Hopkins等人对淘洗器进行了改进(见图1-7),并发现淘洗流出液达4L就可全部回收外标细菌,但是土壤中的细菌只能分离出80%左右。该方法的基本原理是:物质颗粒的沉降速度是其大小和密度的函数:

 V=(r2g/9η)(ρ-1)

式中V为物质颗粒的沉降速度,r是物质颗粒的半径,g是重力加速度,是介质的黏滞度,是物质颗粒的密度。

从上式可以看出,土壤颗粒越大或密度越高,其沉降速度就越快。土壤黏粒粒径一般小于2 ,而其密度约为2.6g·cm-3.土壤中大多数细菌的直径为0.5~3 ,密度为1g·cm-3左右。理论上通过淘洗方法很容易将细菌从土壤悬浮液中分离出来,关键是选择合适的水流速度。该方法最大的缺点就是淘洗出来的水溶液体积比较大(4L),需要通过高速离心或膜过滤(<0.45 )或超滤浓缩细菌。

淘洗法和多次低速离心法所获得的细菌浓缩液还含有一定量的有机物质和黏粒,需要通过梯度离心方法纯化细菌。Macdonald详细地研究了梯度离心的条件,发现在一定密度的介质中高速离心,细菌被分离并集中在离心管的一定部位。曾被用作梯度离心介质的有蔗糖、CsCl、Ludox(硅胶体颗粒)和Percoll(硅胶体颗粒用聚乙稀吡咯烷酮包被起来)等。但由于渗透压、毒性及黏滞度等原因,前三种物质已很少使用。Percoll对微生物没有毒性,通过加入蔗糖或NaCl可以调节其渗透压,是目前用得较多的梯度离心介质。

由于离心时在Percoll介质中出现多个层次,加上抽取不完全等原因,外标细菌的回收率一般只有70%左右。Bakken报道加入黏壤土、沙壤土和有机土中的外标细菌的分离提取率分别为30%、26%和70%,Hopkins等人发现梯度离心在草炭土中的分离效果仅能提取土壤中10%~20%左右的细菌,并且随土壤性质不同有很大的差异。

从土壤中分离真菌菌丝较为困难,以前采用的方法有空气淘洗方法、蔗糖离心方法。Vilarino等人发现用直径为150 的铜丝,通过慢速转动,能够收集90%左右的真菌菌丝,比离心方法的效率要高得多。

 

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