青霉素发酵工艺的研究进展

 

同济大学08级化学系

 

摘要 自青霉素被使用于临床以来，其发酵过程的研究和改进就一直是生化技术的热点。结合国内外研究成果，综合分析了青霉素发酵过程中发酵工艺、检验和控制技术及发酵设备的研究进展，对于从事青霉素发酵过程条件优化、因素控制和设备设计的人员极具参考价值。

关键词: 青霉素 发酵工艺 发酵罐 计算机控制

 

 

Research Progress of

Penicillin Fermentation Technology

 

Junior Students of Chemical Department of Tongji University

 

Abstract: Since penicillin was applied to clinical medicine,the research and improvement of fermentation process have been the hot spot of the biochemist. Comprehensive analysis for penicillin fermentation p technology, inspection and control method and the research progress of fermentation equipment in conditions were involved, has reference value extremely for researchers engaged in penicillin fermentation process optimization,factors control and equipment design.

Key words: penicillin, fermentation technology, fermentor, online detect

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1引言

青霉素自1928年由英国学者弗莱明发现以来，被广泛的应用于临床医学。青霉素作为抗生素使用，可以抑制细菌细胞壁的合成，使细菌溶解、破裂而死亡。与其他抗生素相比，青霉素盐类的半衰期短，水溶性好，组织渗透力较强，毒性极小，性质稳定，价格便宜。

青霉素自被使用于临床以来，由于其良好的疗效和宽的抗菌谱，越来越多的受到各方面的关注，近年来对其研究的热度不减。青霉素发酵过程是典型的生化过程，是通过有生命的微生物的生物代谢活动来完成的。发酵过程中各种参数的控制和改进是提高最终青霉素收率和总效率的保证。但由于各参数都是高度非线性的，要理想的控制显然很困难。

近年来，青霉素发酵工艺的研究进展重要集中在对种子罐搅拌和通气工艺的优化，对接种量和接种方式的改进，对培养工艺的改进,对温度和溶氧的控制等方面。对发酵过程中参数控制方法的研究进展重要集中在模糊控制，通过软件模拟流场，创建集散控制系统,神经网络的研究等方面，这是近期研究的热点。由于发酵设备的设计已经基本成熟，发酵设备的研究较少，主要是细节改进以提高氧的传递。

2概述

2.1化学结构

青霉素化学结构式如下，由两个氨基酸所构成：

 

由于结构中旁键R的不同，可以分为青霉素F、G、X、O、V等。工业上生产的青霉素主要是青霉素G和青霉素V及少量青霉素O的各种盐类制剂。

2.2性状

    青霉素本身是一种白色有机酸晶体，极不稳定，在水溶液中溶解度很小，且很快失效。故医药上常用的是青霉素钾盐或钠盐的精制结晶后配置的溶液。

2.3药理作用

    青霉素具有很广泛的抗菌谱。青霉素作用机理为对敏感的病原微生物具有抑菌和部分的杀菌作用，本质是破坏细菌的新陈代谢，抑制细菌的生长。青霉素应用很广，可作为水溶液注射剂、悬浮液注射剂、油剂、肺内注射剂、口服胶囊剂、片剂、眼膏、软膏、喷雾剂等。

2.4贮藏条件

    由于青霉素性质不太稳定，因此需贮藏于适宜的玻璃容器内，密闭或熔封，在15℃下避湿保存。而青霉素钾盐及水溶液制剂则在干燥处低温保存。

3青霉素的发酵工艺

青霉素的发酵工艺主要有菌种选择、孢子制备、种子培养、发酵、产品分离结晶等几步。传统青霉素发酵工艺为二级补料分批发酵，青霉素孢子通过火焰接种至种子罐无菌培养基，在一定罐温、通气培养条件下发芽生长，经过一定周期后青霉菌菌丝生长达到一定菌丝量至对数生长末期，移入发酵罐无菌培养基培养。在发酵罐中给予一定温度、空气等生长环境，为了实现高水平的发酵单位，需要补入碳源、氮源及合成青霉素的前提物质等，保持培养基中一定的营养。大致生产工艺流程如下：

 

图1.青霉素生产工艺流程

Figure1.Production technology process of penicillin

 

    青霉素产品发酵过程主要包含菌体繁殖阶段和抗生素分泌阶段。本论文着重于种子培养和发酵过程。青霉素种子制备大多采用二级培养，将优选好的菌种接种到种子罐中，在一定的温度和空气量的培养基上培养，形成的大量菌种则送入发酵罐进行产品生产。青霉素发酵过程分为停滞期、菌丝生长期、菌丝生长到次级代谢的转化期、代谢稳定期。发酵过程受发酵温度、培养液酸碱度、氧气量、泡沫量等因素影响。一般霉菌生长要求稍低的温度，而细菌生长则要求较高的温度，青霉素发酵的最适温度为25±1℃。培养液酸碱度在菌丝生长期为pH为6.8，在青霉素分泌期是7.8以上。通气搅拌要求将通入的足量空气打成细泡，均匀分散在培养液中，使青霉菌生长获得充足的氧气，因此通气和搅拌对培养影响也很大。青霉素发酵时产生泡沫，不利于青霉菌代谢时的气体交换而减低产量，同时泡沫溢出，产量受到损失。

4青霉素的控制检验方法

为了便于控制发酵过程，保持生产稳定和逐步提高，达到最佳的结果，应尽可能地通过各种发酵参数的设定和检测了解发酵的全过程。发酵参数分为物理参数、化学参数和生物参数。其中，物理参数包括温度、压力、搅拌速度、搅拌功率、空气流量、黏度、补料流量等，化学参数包括pH值、基质浓度、溶解氧浓度、氧化还原电位、产物生产量、尾气分析等，生物参数包括菌丝形态和菌丝浓度等。现在这些参数大多由计算机来控制。

为有效地控制这些参数，在青霉素发酵过程中必须作各种检验工作，对代谢过程中的单位产量、酸碱度、总糖量、还原糖、氨氮、菌丝浓度等进行测量。

单位产量测定即效价测定，是为了解发酵过程中产量增加情况以正确诊断发酵液收获时间，因此对整个发酵过程十分关键。常用方法有碘滴定法和管碟法。酸碱度随代谢的阶段而变化，故一般要间隔一段时间就使用pH电极测定一次。发酵液糖量一般采用Somogyi检糖法测定。

5青霉素发酵设备

主要有发酵设备、提炼设备和结晶设备。其中最核心的是种子罐和发酵罐。常用的生化反应器有机械搅拌型、气体提升型、固定床生化反应器等。这些在青霉素发酵中都有应用。

 

图2.常见的发酵罐示意图

Figure2.Sketch map of general fermentor

 

6发酵制备青霉素的研究进展

由于青霉素在临床的广泛使用，对青霉素发酵工艺的研究热度不减，下面从三个方面来分述最近的进展。

6.1青霉素发酵工艺的研究进展

青霉素发酵工艺的研究改进一直是科研人员关注的重点，如何提高青霉素的发酵指数、提炼收率和生产指数是从事抗生素生产人员普遍关心的话题。

张晓川^[4]等通过对种子罐搅拌和通气工艺的优化，实现了控制菌丝形态，降低菌丝黏度的目标。由于种子罐装量系数较高，故移种时种子液无法被培养基有效地稀释，导致粘度高N移种时间长、菌丝长时间缺氧，极大地影响了菌丝的生长繁殖以及青霉素发酵生产。而种子液为非牛顿流体，黏度主要取决于种子液的物质组成和菌丝形态，难以进一步优化，只能通过优化搅拌工艺和通气工艺来控制菌丝团直径，达到降低种子液黏度和缩短移种时间的目的。该组研究人员选择了在发酵周期的前1/3时间段内，每隔1h开1min搅拌、通气量为50%；在发酵周期的后2/3时间段内搅拌全开，通气量为100%。结果各项指标均达到移种要求，且节约了15%的压缩空气和近30%的搅拌电力，搅拌电流也下降了10%。

庞巧兰^[5]等采用不同接种量和不同接种方式的对照实验和正交化实验，改进了接种工艺和与之匹配的发酵前期工艺。实验通过种子罐中种子液接种量实验、两种不同种源和发酵周期对发酵提炼生产的影响、两种种源混合介入比例和总接种量的确定及混合接入发酵罐前期工艺优化五方面，得到较优的方法为：采用两种种源混合接入，总接种量为30%，其中种子罐种子液的接种量为20%。发酵至60h的前期发酵液的接种量为10%。工艺改进后，和单种源工艺相比，发酵指数提高了10.8%，提炼效率提高了0.4%，发酵提炼的生产指数提高了11.2%，显著提高了青霉素的生产效益，具有较高的生产推广价值。

张敬书^[6]等对青霉素发酵过程的低单位带放菌丝收集至带放罐再培养，同时补充部分发酵基础料培养基，使新生部分菌丝的同时进行高单位发酵，节省了种子的培养过程，在兼顾增大青霉素产率和降低环保菌丝处理实行清洁生产方面收到良好效果。实验结果表明，使用1/3培养基比例的情况下带放再培养工艺最合理，提高单罐批发酵产量收率15%，增大发酵液产量明显。

康立宏^[7]等为提高发酵单位产量，想到在青霉素发酵中采用变温控制法。通过分组进行摇瓶实验，最终比较效价，得出青霉素发酵前期0~50h把温度控制在最适合青霉菌生长的30℃，可促进菌丝迅速生长，尽可能提前进入抗生素分泌期；在51~160h间，把温度控制在最适于青霉素合成的20℃，可增加抗生素分泌量并维持较长的分泌期，而160h后又升温培养，可刺激抗生素的分泌。因此，在青霉素发酵过程中，在不同的发酵阶段控制不同的最适培养温度，采取变温培养的方式，可以提高发酵单位，增加青霉素产量。

崔丽娟^[8]等针对国内大部分青霉素设备都是用来生产青霉素G工业盐的情况，从质量控制方法、发酵工艺、提取分离技术、结晶工艺及应用研究进展方面综述了青霉素V钾的合成工艺，介绍了青霉素V钾在半合成抗生素生产中的发展优势，并对青霉素V钾今后的技术发展方向提出几点建议：1，积极拓展半合成抗生素生产领域；2，增加技术创新投入，提高产品质量，降低生产成本，减少环境污染。

染菌问题一直是抗生素生产行业关注的焦点之一。郭胜利^[9]等从物料方面、设备方面、蒸汽(空气)因素及人为因素等方面较为全面地阐述了造成染菌的可能性，以便帮助抗生素生产者准确查找染菌原因，预防染菌。该研究也恰当地解释了青霉素发酵中的染菌问题原因及预防措施。

以色列的Eyal Dassau^[10]等采用Six-sigma的方法来控制青霉素发酵过程以增加总效率，缩短循环周期。他们采用了PAT(Process analytical technologies)方法来抽取数据，利用6σ综合过程模型、advanced process control(APC) 和statistical process control (SPC)来找出引起低收率的原因，这种方法会对制药工业产生实质性的影响，可以提高收率和产品质量，更好地收回投资。

6.2青霉素发酵控制的研究进展

张粤^[11]介绍了青霉素发酵罐温度模糊控制系统的设计与开发，系统采用主流的VB开发工具，包括以下主要功能：对各种待监测对象的实时动画监控；对运行设备状态数据的实时采集、处理、存储、报警及打印；合法用户的帐号管理及操作记录；实时及历史数据的维护和管理。以上设计的模糊控制器已成功的应用于青霉素发酵罐温度控制系统，取得了良好的控制效果。系统超调量小、控制性能稳定、抗干扰能力强，且算法简单、执行快。

赵丽丽^[12]等实验研究了使用梅特勒O₂-sensor溶氧电极进行了青霉素G发酵过程中的溶氧控制，经过十批次发酵罐数据统计，使用梅特勒02-Sensor溶氧电饭进行溶氧控制后，青霉素发酵平均单位达到68040u/ml，比以前提高16.5％，发酵液顶处理操作也更加顺利，其成品青霉素T业盐各项理化指标均达到企控优级标准。由于发酵单位的提高，青霉素工业盐产量也大幅度提高，同时获得了可观的经济效益。

夏建业^[13]等通过CFD软件包STAR-CD模拟了一种新型离心式搅拌生物反应嚣(CIB)在各种操作条件下的流场。并通过模拟得到了该种新型搅拌生曲反应器主要的设计和操作参数．应用STAR-CD主要模拟了CIB中的速度矢量场、循环流t以受剪切场的分布。搅拌桨叶端速度分量的模拟值和实验结果进行了比较，模拟的切向速度分量与实验值吻合很好，而径向速度分量在搅拌转速较大时出现一定偏差。另外通过模拟计算得到的通过高心式揽拌桨(CI)导流筒的流量与循环流量经验方差(Q∝D×N)基本吻合。最后通过模拟CIB中剪切场分布，提出了CIB在应用于动物细胞培养的最佳操作条件。但对于青霉素发酵过程中内流场的控制尚未有报道。

汪志锋^[14]等采用SUPCON JX-300 X DCS集散控制系统，结合青霉素发酵生产工艺，制定了以补料控制为基础、以温度控制、pH控制和消沫控制为调节方式的生产自动控制实现方案，满足了青霉素发酵这种时变、非线性、多变量输入输出的复杂生产过程控制的要求。系统给出了以JX-300 X为主体设备，发酵车间多罐批集控模式的系统配置及软件组态过程。系统具有安全性高、适应性强、操作简单等特点。该方法大大提高了生产的自动化程度和管理水平。具有积极的推广应用价值。

青霉素发酵是一种复杂的生物化学反应过程，具有高度的非线性、时变性和不确定性，很难通过数学解析或实验法得到一个精确的数学模型。就补料过程而言，随着发酵的进行，微生物的生长和生物代谢都要求连续不断地补充营养物质，使微生物沿着优化的生长轨迹生长，以获得高产的微生物代谢物。目前，还没有一种仪器能准确的在线测量微生物的浓度和代谢状况，这使得补料控制极为困难，一般的发酵工业生产过程是依据实验室大量的试验结果，从而得出一个近似的补料轨迹线并用此指导补料过程，但是这种方法指导下的补料控制效果还要受到其他不确定因素的影响，就目前而言，精确的理化参数测量、执行机构稳定的工作状态和智能优化算法的合理使用会使发酵工艺朝着理想的方向发展。张中明^[15]等对青霉素发酵的工艺流程、参数测量方法、朴料装置的结构和控制过程的时序分析进行了绘出了DCS与现场设备连接的神经网络结构图，对发酵过程中如何优化补料控制和基于神经网络实现补糖控制的算法进行了研究。葛爱冬^[16]围绕神经网络理论在发酵过程中的建模问题，概括总结了发酵过程的建模方法，国内外的研究现状，对最新进展进行了总结和评述，介绍了软测量技术和软测量技术在发酵过程中的应用。研究了一种新型的前向神经网络-FLAT神经网络仿真实验结果表明FLAT网络辨识精度高、学习速度快、泛化能力强。根据可在线测量过程参数CER，应用其提出的广义混合神经网络建模方法，根据青霉素发酵过程中的特点，实现了青霉素发酵过程生物质浓度、过程工艺和参数的测量。

李文娟^[17]在其硕士学位论文中论述了青霉素发酵过程中的解耦控制与数字化的实现，青霉素发酵过程是一个非线性、不确定性、强耦合性的过程，要对青霉素发酵过程进行优化控制，涉及到有关参数的监测、建模和如何实现最优控制的问题等方面的内容。由于青霉素发酵过程关键生物量(菌体浓度、基质浓度和产物浓度)之间的强耦合关系，因此，传统的线性处理方法显然不合适，很多学者尝试运用遗传算法、神经网络等方法来实现发酵过程的优化控制，但是这些方法都没有实现动态解耦控制，没有解决根本问题。该论文在逆系统基础上，针对难以得到青霉素发酵过程精确数学模型的问题，提出了基于神经网络与逆系统相结合的解耦控制系统，运用神经网络逆解耦控制方法成功对青霉素发酵过程的三个生物量(菌体浓度、基质浓度和产物浓度)进行了解耦控制，仿真实验表明此方法实现了解耦的目的。该方法也为解决类似的生物发酵过程最优化控制的关键问题之——具有耦合性参数的控制问题提供了一个新的思路、新的方向。此外，针对青霉素发酵过程提出了一套完整的数字控制系统，对其中的主要参数实现控制。

美国得克萨斯大学的Jie Yu^[18]在其发表论文中阐述了一种新颖的生化过程在线检测的方法，MKLFDA（multiway kernel localized Fisher discriminant analysis）。这种方法把费舍尔残差分析整合到核心方程中使得可以分离多项高斯性的数据簇。此外，这种综合方法可以将三位的数据转化为二维数据，简化了检测和分析，减少了误差，实验结果表明，MKLFDA方法监测非正常操作条件明显好于之前的MFDA方法，具有很高的错误察觉性能和较低的误测。国外其他文献也有类似监测方法的报道^[19]~[20]。

6.3青霉素发酵设备的研究进展

    相比于工艺和控制，设备研究和设计方面的论文就相比较少。

陈钊^[21]在其硕士论文中介绍了其对120M³青霉素发酵罐的研究改进设计，罐底层采用的是六叶平桨圆盘涡轮式搅拌器，上面三层搅拌器是新型轴流搅拌器。新罐安装到位后，在同一生产场所对照原有的lOOm³发酵罐进行了生产规模的试验测试，原罐采用的是三层六叶平桨圆盘涡轮式搅拌器。试验罐与对照罐都是在整个发酵周期内，每4小时记录一次仪表指示数据或化学分析数据。试验共采集了八批数据，通过对这些数据的对比研究发现，新设计与纯径流搅拌器组合相比，轴、径流搅拌器混合编组搅拌系统可以明显地改善搅拌效果。特别对于大体积的发酵罐，改善效果更为明显。最终结果表明，试验罐的青霉素平均发酵单位为482600unit/ml，对照罐的青霉索平均发酵单位为442000unit/ml，发酵单位水平提高了9.19％。故其认为，这种新型搅拌系统的应用，为解决发酵罐放大问题提供了一种新方法，为抗生素生产向更大规模发展找到了新途径。

杨俊^[22]在其硕士论文中进行了下喷式液泵型生物反应器的基础研究，其设计了一种新型下喷式液泵型生物反应器，并对其导流筒尺寸进行了优化试验，得出了导流筒的最佳结构尺寸。通过三因素三水平正交试验，得出了各因素对溶氧传质性能的重要性顺序以及因素水平变化与K_La值的变化规律，在试验范围内得出了最佳组合;通过采用不同的取样高度得出了其对容积氧传递系数的影响曲线，随着取样高度的增加，容积氧传递系数呈上升趋势；测试了不同通风比情况下容积氧传递系数的变化规律，并与磁力搅拌生物反应器进行了对比试验。该设计对实际情况有很好的指导作用。

廖春燕^[23]等撰文讨论了固态发酵（Solid State Fermentation，SSF）在抗生素生产中应用的可能性，提出影响生物反应器设计的因素主要有氧的传递、菌体的形态学以及其对机械剪切力的抵抗性及是否需要无菌发酵过程三方面，虽然在设计方面已经取得了很大的进展，但仍需要研究，使固态发酵产品的更新换代得到更快发展，更快地提高生产效率，提高哦企业的综合效益。

在专利申请方面，抗生素发酵设备的设计发明较多。例如甘柏林^[24]等人的高效节能抗生素发酵罐，在罐内的搅拌轴上段装有四宽叶旋桨，中段装有三窄叶旋桨，下段装有六抛物线桨叶，形成三级组合式搅拌；底层搅拌与罐底间设有圆环式喷射混合器。这些设计克服了传统发酵罐结构的缺陷，使得结构更趋于合理、科学、为抗生素发酵行业的发展将发挥积极作用。

7结论

从以上分析可以得出如下结论：

1.青霉素发酵工艺经过50多年的发展，基本已经成熟，但在细节方面仍在不断完善和改进。

2.青霉素制备的工艺改进主要在接种过程的优化和发酵过程参数的优化两方面。一些新的工艺方法可以增加单位效价，提高产品质量和收率，降低生产成本。

3.随着计算机技术的发展，青霉素发酵过程中各种参数的在线模拟和检测是近几年来研究的热点，国内外提出很多方法，对发酵过程的控制都具有一定的效果，但仍需进一步完善和统一。

4.发酵设备的设计进展研究较少，说明现今的设备工艺基本已经成熟，一些文献和发明专利主要是改进以提高氧的传递速度，获得更高的收率。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

参考文献

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