晨光的博客

流式细胞凋亡检测Q&A（一）Time：2009-06-14 PM 13:11　　Author:bioer　　Hits: 99 times 　1、Q：rh Annexin V R-PE 20 tests是BD公司用于凋亡流式检测的试剂盒，产品显示种属为人，请问能否用于大鼠细胞的检测？
A：可以。因为Annexin V是与PS亲和，而PS在不同种属间应该没差异。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。

        Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
2、Q：用流式作细胞凋亡为什么跟tunel差别那么大啊？？

        tunel测出来的细胞凋亡率大概有30%而作流式测出来的凋亡率只有2%（阴性对照0.5%）差别好大啊，用的是beckman公司的Annexin V /PI双染试剂盒，实验步骤如下：
（1）胰酶消化贴壁细胞，加培养基中止，离心1000转5min
（2）吸去上清，PBS0.5ml 重悬细胞（因为要送到别处作流式，期间路程约1h，户外温度约37度）
（3）然后加入Annexin V /PI各5微升，避光20min，上机。
请问这是什么原因导致的？
A：我也用这两种方法做过凋亡，是存在两种方法测的凋亡率差别有点大，但还没有大到你这样的程度。双染测的是凋亡的早期事件PS外翻。TUNEL测的是凋亡最晚期的事件DNA片段化。而且TUNEL在检测过程中，把操作损伤细胞和坏死细胞当作了凋亡细胞，而且如果TUNEL是肉眼计数的话，也会有判断上的误差，所以，往往TUNEL作出来的凋亡率高一点。但如果凋亡率达到30%，ladder估计也应该跑的出来。

        双染虽然是机器操作，但在调试补偿时，人为的影响还是挺明显的，也不是特别的客观。基线稍微左移，你的凋亡率就成倍上升。所以，给你的建议是在经费、时间允许的范围内再多做几次吧。感觉这么大的差异，可能这两种方法都会存在问题。还有，去流式的路上，装细胞的ep管最好插在冰上，拿着冰盒。
3、Q：可以用液氮保存瘤组织块，然后再做流式细胞分析吗？
A：我认为是不能的。因为流式细胞分析要求细胞分散、单个，活性好，这样才能区分死亡、凋亡和活性细胞。组织在冻存、复温的过程中会有大量的细胞死亡，同时经过这一过程的组织在分离成单个细胞的时候会形成许多细胞碎片，不宜上流式检测了，所以用于流式检测的标本最好是新鲜标本，即取材后立即检测，效果最好。
        我以前也试图将组织存入-80℃，然后进行流式检测，结果发现后来处理的组织细胞不是粘团就是破碎，根本无法检测。如果你实在找不到可以检测的流式细胞仪，我建议你可以将组织标本进行切片，然后做原位染色，观察组织细胞的凋亡。
        我们实验室的肿瘤组织块一部分冻存于液氮用于以后提蛋白做Western或提RNA做RT-PCR，另一部分用10%的甲醛固定用于以后做免疫组化。
4、Q：有关流式前收集细胞的问题

贴壁细胞做流式前用胰酶消化下来对细胞膜损伤小还是用细胞刮刮下来损伤小？

种在板里的贴壁细胞可以先染PI然后再消化下来吗？

这样是否可以减小由于消化液造成的细胞膜破损而染上的PI的误差？
A：我想做NK细胞对肿瘤细胞的杀伤实验，用MTT做了很多回，但只有NK细胞的对照组OD值就和肿瘤对照组差不多高了，这样NK细胞杀伤肿瘤细胞后自身的变化对抑制率的影响会很大，所以想用流式来测肿瘤细胞的凋亡。我担心胰酶消化会造成细胞膜的损伤，这样就会有一些细胞因消化的原因染上PI，所以想尝试先染PI，洗掉多余的PI后再用胰酶把细胞消化下来，不知道可不可以。

        低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞2～3次，吊桶式离心机4度1000rpm 3～5min离心，处理得当的话，胰酶造成损伤可以控制在5%以内，有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。而先加PI不仅染色是否每组都均匀充分很难判断，而且PI本身对细胞也是有毒性的，对你的实验结果影响会比胰酶大，个人不建议这样做。
5、Q：做流式细胞过程中，由于不能用胰酶消化贴壁细胞，还有其他什么方法吗？

        由于293细胞贴壁能力很强，现在要做流式，要把贴在培养皿壁上的细胞消化下来。但又不能用胰酶消化，我试着用1毫升的1mM的EDTA消化20min，结果细胞很难消化下来。最后，去做流式检测结果很差。不知道还有其他什么更好的消化方法，但又不破坏细胞膜的表面结构。
A：不是不能用胰酶消化是不能用含有EDTA的胰酶消化，因为annexinV是Ca依赖的蛋白，所以不能加入EDTA， 防止EDTA螯合了Ca离子从而影响annexinV，进而影响结果。所以你可以用不含EDTA的胰酶，放入温箱内进行消化，时间可以长一点，随时观察细胞情况，避免消化过度。建议用细胞刮子把细胞刮下来，然后用枪吹匀，比消化还简单，而且也避免了胰酶带来的损伤，机械的损伤还是很小的因为细胞大多呈大片大片地被刮下来。
6、Q：流式测凋亡为何左上象限出奇的高？
A：看了你的数据，我觉得第一跟你的细胞状态很有关系，你说对照组中间也有很多死细胞，而且你做实验时也吸上来了，坏死的细胞和凋亡的细胞是不一样的，如果细胞坏死破裂很多的话这时左上象限PI就很高了，再则，PI染的时间5-10分钟就可以了。我做的时候是采用PI和Annexin V分开染，PI先染或离心去掉染液，然后再加结合液和Annexin V10分钟后上机检测。PBS洗的目的有利于Annexin V的结合反应，为了缩短实验时间和较少细胞损失，我一般也就洗一次。

        最后，我个人的观点是做实验时，细胞状态一定要好的情况下去做，不要勉强，这一既浪费试剂和时间，也往往得不到好的可靠的结果。你做的是贴壁细胞，中间有好多死的细胞，你可以先接种细胞，待细胞贴壁好了，然后再换一次液，这样就把那些死细胞去掉，接下来再加药物。
7、Q：请教做流式细胞仪检测细胞凋亡，那种方法比较好？也比较经济实惠？Annexin V/PI双染色法和Hoechst/PI双染法哪种更好一点？
A：Hoechst/PI染色在流式分析中并不常见。Hoechst需要紫外激发，因此只有在配备了相应激发光源的流式细胞仪上才能使用。我的印象中，不少地方的分选用流式为了用Hoechst分析sp表型的干细胞，配备了此激发光源，但是普通的分析用流式，多半是没有配备的。
8、Q：流式细胞仪检测凋亡如何算是否有统计学意义？
A：用流式检测凋亡时，PI受时间的影响很大，因标记了PI后会加大细胞毒性，随着时间延长会导致PI的染色增加，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大。一般的说明书都会标明，PI在上机前5分钟加，然后在一个小时内检测。

        根据以前做流式凋亡时的经验，我个人认为，一般每组实验一次可以先做三个复孔，上机前5分钟加PI，最好在半小时内检测完毕。这时可以先分析下三个复孔的差异。等待摸索的实验条件成熟后，每组实验一次可以做6~8个复孔，然后做统计学分析。严格说来，当做出统计学差异时，这样的实验还要重复三次。

        但是因检测凋亡时，受细胞状态，PI染色时间，流式检测时间，以及每次实验时的误差等的影响外，很难保证能够完全重复出上次的结果，甚至即使在保证了实验条件几乎相同的情况下，每次重复的差异也会出现加大的情况。这时可以适当重复2~3次，尽量使差异减小。
9、Q：如何用Hoechst33342/PI流式检测凋亡？
A：标记完以后，若用流式检测，坏死细胞与凋亡细胞的峰形是不一样的，坏死细胞呈反抛物线，而凋亡细胞呈正常，应是双曲线吧，很容易区分的。关于PI与Hoechst33342作用：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期凋亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。

        正常细胞和中早期凋亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒；而凋亡细胞的核由于浓集而呈亮蓝色，或核呈分叶，碎片状，边集。 故PI着色为坏死细胞；亮蓝色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为凋亡细胞。

本文来源于：生物问问博客,原文地址：http://www.bioask.cn/html/193.html

流式细胞周期检测Q&A（二）Time：2009-06-15 PM 13:52　　Author:bioer　　Hits: 110 times 　1、Q：要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？
A：我做过乳腺细胞的DNA含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%.
2、实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题：
Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？
A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。
Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？
A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。
Q：（3）Triton x-100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton x-100固定了？
A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。
Q：（4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？
A：对照肯定是需要的，这个根据自己的需要进行设置。
Q：（5）不用试剂盒行不行啊？
A：完全可以不用试剂盒。
以下提供一个自己的实验步骤供参考：
（1）200×g离心10min收集细胞；
（2）弃去上清，PBS漂洗一次，将细胞重悬于预冷的70%乙醇中，-20°C固定24h以上；
（3）进行流式细胞仪检测前，200×g离心10min收集固定后的细胞；
（4）PBS洗涤一次，200×g离心10min收集细胞；
（5）将细胞重悬于含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中，室温孵育30min；
（6）将经PI染色和RNase A消化后的细胞悬液用400目的尼龙膜过滤后即可利用流式细胞仪进行细胞周期分布和凋亡细胞定量的分析。
3、Q：流式检测细胞周期时加RNA酶所需的温度？
A：其实有关RNA酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见，该观点的人认为RNA酶在环境中无所不在，常规制样过程中所接触的试剂和环境中的RNA酶已足以降解样品中的RNA，所以为了简便实验操作，也有人不加RNA酶或如你所参考的方法将其与PI染液一起使用。不过经典的方法还是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI 4度孵育30min”
        至于染色时使用4度，是因为低温可减弱分子运动，增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。

4、Q：我养肿瘤细胞，测周期。看到帖子说70％乙醇必须用PBS和乙醇配，用水配细胞会碎裂，有帖子说PBS和乙醇配会出现絮状物。上流式前细胞用75％乙醇固定，就用买来的现成的瓶装75％乙醇，行吗？必须那么严格吗？
A：先用冷PBS悬浮细胞，大约1-2ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。
5、Q：我要做流式分析细胞周期，我大概收集了10的6次方细胞，但细胞在乙醇固定之后，还看到有细胞沉淀的，但PBS洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机发现就发现不了细胞了。这是怎么回事啊？怎么解决这个问题啊？
A：很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有：
（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机
（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。
（3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿
（4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。
6、Q：流式细胞PI单染中为什么用RNAase？
A：在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI很容易透过细胞膜和DNA结合，但RNA也是核酸，也会被染色，为避免干扰染色前需用RNAse降解RNA。这样PI只染DNA，能精确以荧光强度反映DNA的含量。
7、最近做了几次流式细胞仪检测细胞周期，发现有几个问题：
Q：（1）我所用的是肿瘤细胞， 但是同样的细胞类型，同样的处理因素，虽然两次独立实验作出来的结果总体趋势都是在某种药物干预后，S期比例下降，但两次结果S期比列具体数值相差很大，同样，G2/M期在干预前后无变化，但两次独立实验数值却相差很大，那么可以说，做流式是每次细胞状态不一样，结果也会相差很大，是不是细胞密度会对结果产生很大影响，那么如果细胞密度在60-70%时和细胞已经长满（90%以上）也会导致各期数值的差异？如果是这样，长满的细胞（不再增殖）是表现的G1或S或G2/M上升还是下降？
A：应该是两批细胞在实验时本身所出周期不同所致，可以在实验前进行细胞的同步化处理，减少批间差异。实验细胞应处于对数生长期，而不能是完全长满，一般在50～80％比较好。自然状态下，不增殖的细胞应该处于G0/G1期。
Q：（2）其次就是结果分析，细胞周期特异性药物如抗代谢药作用后主要表现的是S期比例下降，细胞被阻滞在G1期，自然G1期比例升高。而有些植物药如长春碱类或紫杉醇类，主要作用于M期，那么结果是否表现为G2期比例升高，还是S期也相应升高？还有就是细胞经抗肿瘤药物作用后反而出现的S期升高，可能是哪些原因，如何分析？
A：周期特异性药物阻滞哪一期，哪一期就升高，不会使其它阶段细胞增多。
8、Q：我用流式做胃癌细胞周期分析时不出现S、G2/M峰？什么原因呢？自己分析可能为PI没染上色，是不是染色时间太短呢？
A：你用了多少PI染色多久呢？一般来说30分钟够了.我觉得可能是打孔或者RNA没有处理掉没有成功，染色时间并不是关键。
9、Q：做流式细胞时，PI 染色，PI的浓度应该是多少?还有就是400目的筛网是什么？不用可以吗？
A：100ug/ml，一般用400目的筛网是用来将粘在一起的细胞团滤掉的，否则会出现人为的多倍体干扰，分析的时候需要的是单个的细胞，不过如果经验丰富也可以gate掉的。如果你没有条件，建议在染色之前将细胞弹的很散，再进行染色
10、Q：流式细胞仪观察细胞周期样品怎样准备？
A：给你介绍一下我的实验方法，我做的是周期检测，要做平行样，六孔板做的。
（1）收集先弃液，将你要实验（你已经处理好的）的细胞PBS洗两次，加胰酶消化（注意：如果要是加药物或者其他处理过的细胞，弃液和PBS洗液均收集）；
（2）加培养基终止消化，打匀再分别收到各自离心管中（注意，收集过程中及后续过程中枪头不要混用，要不平行样也就没意思了）；
（3）离心，1000rpm，5min弃液；
（4）4度PBS（1到2ml）洗两次，离心，1000rpm，5min弃液；
（5）加入-20度70%酒精（1到2ml）打匀，固定，至少半个小时以上，（不做的话，可放入4度冰箱保存2-3周问题不大）；
（6）离心，1000rpm，5min弃酒精；
（7）4度PBS（1到2ml）洗，离心1000rpm，5min弃液；
（8）4度PBS（1到2ml）洗，打匀后，将细胞悬液用100 目的纱布直接过滤到流式检测管中；
（9）离心，1000rpm，5min弃液；
（10）加PI染液染色（浓度为50ug/ml），PBS32.4ml ，PI 2.5mg，Rnase 0.5mg，（Triton-X-100 0.25ml，枸橼酸钠50mg，这两样我没加效果也不错）加PBS至50ml，4度避光保存数月。106细胞中加入1ml PI染液， 振荡器振匀，避光染色至少30min， 上机检测；
（11）统计分析

本文来源于：生物问问博客,原文地址：http://www.bioask.cn/html/194.html