华叶的博客

乳酸杆菌作为受体菌的研究及应用

    乳酸杆菌（Lactobacillus）作为一种益生菌是大自然赋予人类的宝贵财富,它作为益生菌已有相当长的历史。是一类广泛用于食品工业的革兰阳性杆菌,利用分子生物学技术可改造乳酸杆菌的性状，满足人类需要。但相对于大肠杆菌，乳酸杆菌基因工程尚处于开发阶段。最近,国内外学者开始把乳酸杆菌作为外源基因表达载体有目的、有选择地研制新一代微生态制剂。近20年中，研究者构建了多种乳酸杆菌载体，并表达了多种蛋白。鉴于乳酸杆菌是人体的正常菌群，因此把乳酸杆菌作为载体来表达蛋白,将会是一个很具有诱惑力的研究方向。
    1、乳酸杆菌质粒载体特点
    乳酸杆菌是一类革兰阳性杆菌，微需氧或厌氧，发酵产生乳酸，最适生长pH值为4～6。目前已从哺乳动物粪便、阴道分泌物、奶酪、酸菜等分离到70多种乳酸杆菌。乳酸杆菌之所以能成为理想的表达载体主要是由于大部分乳酸杆菌都携带质粒，尤其是小质粒都是隐蔽性的，这些小型质粒多进行滚环复制(RCR)，其结构与革兰氏阳性菌的其它RCR质粒结构相似，最小复制域在大小上也是类似的;这些质粒都有一个广泛的宿主范围的表型,可以在不同乳酸杆菌中复制,而且在不同的乳酸杆菌中拷贝数没有明显的变化;乳杆菌的质粒结构较稳定,在发酵过程中质粒能保持结构的完整,没有选择压力的情况,在不同的环境胁迫下可以进行不同的诱导表达，能够稳定的存在于宿主细胞内，这将有助于在乳杆菌中进行基因克隆;分离的稳定性等分子生物学特点决定了乳酸杆菌能作为很多基因的载体[1、2]。除了以上的一些特点外，乳杆菌能成为理想的疫苗载体主要还要归功于乳酸杆菌与免疫应答之间的关系， Marteau.P.C等许多实验证明用禽流感血凝素亚单位疫苗免疫动物前,反复给动物饲喂乳酸杆菌,结果免疫后动物体内的抗体滴度将会提高5倍,表明乳酸杆菌本身对免疫应答有重要的调节作用, 这主要由于乳酸杆菌参与先天性免疫，体液免疫和细胞免疫的结果, 乳杆菌参与先天性免疫能够较强的活化巨噬细胞，参与体液免疫产生IgA、IgM和IgG; Cross.M.L等实验表明LGG对轮状病毒腹泻有很好的治疗作用，这主要还是因为它能刺激机体产生IgA、IgM和IgG；乳酸杆菌对免疫应答的调节还在于它参与细胞免疫产生的细胞因子, Maassen.C.B实验表明鼠李糖杆菌(L.rhamnosusHNOO1)能诱导产生TH1和TH2，有8种乳酸杆菌已经证明对感染的动物体内细胞因子的产生具有重要的调节作用，罗伊氏乳杆菌（L.reuteri）、短乳杆菌（L.brevis） 还能诱导产生TNF-α和IL-2,有些乳杆菌还能强烈的诱导IL-6、IL-1、IL12、TNF-α（干酪乳杆菌-L.casei）的产生，从而对免疫应答起到重要的调节重要，鉴于以上乳酸杆菌的这些特点,从而使它成为一种理想的,应用前景比较广阔的受体菌
    2、乳酸杆菌作为食品级载体
    乳酸杆菌发酵食品具有很悠久的历史，当今世界发展的潮流是营养保健食品，即不仅具
有一般食品所具有的营养和色、香、味，而且还具有调节人体生理功能的食品。从乳酸杆菌发酵食品的特点中可以看出，乳酸杆菌发酵食品属于营养保健品，发展乳酸杆菌作为食品的受体菌符合时代要求,因此，它具有强大的生命力和广阔的前景。食品工业将是一次全新的革命：质粒pBG10（瑞士乳杆菌）携带有pAMB1的ery基因启动子及编码L．bulgari—cus B一半乳糖苷酶基因, 将BaciI1us．icheniformis的α一淀粉酶结构基因(1536bp)插入pBGIO的红霉素抗性基因启动子区下游, 即可在L．helveticus SBT2195中获得成功表达, 它对于牛奶中以乳糖作为唯一能源的转化子的筛选将极有帮助。质粒pLP3537xyl携带有来自L．pentosus与木糖代谢有关的基因，经转化乳杆菌，可使其获得分解利用作为唯一能源的木糖的能力。Okafor等人将编码8一赖氨酸的合成赖氨酸基因克隆至载体pBLuescript1，以1ac为启动子，该合成的赖氨酸基因可成功地转化几种乳杆菌。经转化后一赖氨酸分泌量可提高2.5～6倍 [5]。其次纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、胆固醇氧化酶等也在乳酸杆菌中得到表达[4、6]。也可以用乳酸杆菌来研制儿童用增铁营养品，铁离子必须与转铁蛋白结合后才能为人体吸收，因此可在乳酸菌中分泌表达转铁蛋白来使食品中增加铁的吸收性能。
3、乳杆菌可作为免疫疫苗载体
乳酸杆菌另一个在医学领域具有很大应用潜力的方向是将其作为某些免疫接种的疫苗载体。乳酸杆菌作为疫苗载体具有较大的优越性：（1）在呼吸系统、消化系统、泌尿系统定植，对维持微生态平衡很重要；（2）在发酵食物中应用了几个世纪，被认为是GRAS（Generally Recognized As Safe）微生物；（3）同肠胃外免疫途径相比，通过黏膜免疫，可以诱发IgA产生；（4）免疫方便、便宜、安全，不需要注射；（5）具有免疫佐剂作用；（6）同其它活载体（如减毒大肠杆菌、沙门氏菌、病毒）相比，乳酸杆菌作载体无免疫原性，所以无病原性、食物级或共生、共栖性的乳酸杆菌作为疫苗载体受到广泛关注。对这一方面的探索在国外也开展了较多[2]。
3.1、作为hCGβ避孕疫苗载体
人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin, HCG），HCG是由胎盘绒毛组织的合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，其作用是维持并刺激妊娠黄体产生孕酮，促进蜕膜细胞发育成熟。因此，hCG 可作为避孕疫苗的抗原靶。由于hCGa亚单位与hLH，hFSH，hTSH 完全同源，现有的抗hCG 避孕疫苗均采用其β亚单位或更具特异性的hCGβ一CTP(羧基端109～145间的37肽)作为免疫原。[7]
王红梅等用PCR从短小乳酸杆菌染色体中扩增得到S-层蛋白的信号肽序列，将其与hCGβ基因连接后克隆到乳酸杆菌整合型表达载体pIlac的lac启动子下游，得到质粒pIlac hCGβ电穿孔转化Lb．caseiCECT5276。在含红霉素培养基中培养，挑选转化后的耐药菌落，抽提其染色体DNA，PCR 及测序鉴定证实hCGβ基因整合到Lb．casei的基因组中,细菌产生的目的蛋白约有3/4分泌进入培养上清，而加入诱导剂乳糖21 h后，上清中的蛋白浓度达到峰值，为440 mIU／mL。重组菌在无选择压力条件下培养50代后仍可分泌hCGβ。在获得稳定、分泌性表达的hCGβ菌株后，接种于8周龄BALB／C雌性小鼠的阴道粘膜。于免疫后2周取阴道洗液，放免法检测hCGβ水平，间接ELISA检测抗hCGβIgA抗体水平。阴道洗液中的抗hCGβIgA抗体OD值为0.297，明显高于阴性对照组(P <0.O1)，而与DNA免疫组无显著性差异(P >0.05)。结论表明hCGβ在Lb.casei CECT5276中得到了稳定的分泌性表达。
重组hCGβ乳酸杆菌可在阴道粘膜局部定居，并通过粘膜免疫在局部刺激产生抗hCGβIgA抗体。hCGβ疫苗是第一个进入临床试验的避孕疫苗。其中印度Talwar构建的hCGβ一HSD疫苗已进入临床II期试验。然而，即使是hCGβ一HSD疫苗，仅能使约80 的受试妇女抗体水平达到避孕阈值。因此，还需寻找更好的免疫方法及免疫途径来提高。[7、8]
3.2、用作病原菌的表达载体
大部分乳酸杆菌都有很强的免疫刺激能力,目前很多的病原菌已在乳酸杆菌中获得了成功的表达,也许不久的将来，儿童接种预防某些疾病的疫苗不是通过打针而是通过喝酸奶。
已获得表达的病原菌主要有: 炭疽杆菌抗原破伤风毒素片断C抗原(TTFC)在嗜酸乳杆菌中的表达,其重组菌通过鼻内途径免疫小鼠后均显示一定的免疫原性，能够诱导保护性的免疫应答产生系统免疫球蛋白（IgG1、IgG1b、IgG2a）、IgA及检测到特异性T细胞应答[3]; Philippe等用副干酪乳杆菌在细胞内已成功地表达了霍乱毒素B亚单位(CTB); 化脓链球菌M6-gp41E蛋白(Pascal Hols); 还有人在乳杆菌中成功表达了提取抗原prtB—Ttmim(蛋白酶—破伤风毒素)，此融合蛋白作为一个细胞表面蛋白既可诱发系统性免疫应答又可诱发局部黏膜免疫应答[5]; 美国科学家Tabagchalis,将幽门螺杆菌(HP)尿素酶基因在乳酸杆菌中表达,已经申请了专利, 他将尿素酶整合到乳酸杆菌中,把表达尿素酶用作抗原免疫动物,取得了理想的免疫效果,OscarG等将HP尿素酶A和B整合到减毒乳酸杆菌中,也已申请了专利[9]。
抗布鲁士菌抗体：巴西米纳斯州联邦大学和法国全国农学研究所的科学家等已经成功地将布鲁士病菌的一个基因植入乳酸杆菌的基因组。初步实验显示，白鼠服用这种布鲁士病菌疫苗后，体内产生了大量抗体；四川用嗜酸乳酸菌Z97株为载体，构建了可以经口接种的乙肝核酸疫苗，给正常小鼠经口接种2周后，该种核酸疫苗均出现抗-HBs，至免疫后12周时，各组累积阳转率为66.7%-80%[10]；抗HCV/HBV的乳酸杆菌的重组活疫苗：将人工合成的具有良好HCV免疫特异性的多表位抗原基因PCX与HBV pre-S1基因连接成S1PCX基因，克隆于乳酸菌表达载体pTRKL2中，在乳酸杆菌ATCC521中获得表达，构建的重组嗜酸乳杆菌ATCC521（pTRKL2/S1PCX）口服免疫小鼠后，于第12周可检测到低水平的抗-GZ-S12 IgG和抗-GZ-PCX IgG，小鼠外周血CD8+ T细胞出现增殖反应[11]；传染性胃肠炎冠状病毒纤突糖蛋白(TGEV)的克隆，糖蛋白S是TGEV的代表性抗原，目前S糖蛋白已经在Lb.casei中成功克隆表达，主要是扩增编码S糖蛋白的长为2.3kbp的基因片断后，克隆到质粒pLP500中，然后把重组质粒pLP500-rTGEV-S经过电穿孔的方法导入LcS，经western blot检测后，得到S糖蛋白在Lb.casei中得到了表达，然后用重组的LcS免疫BALB/c小鼠后就会诱导机体产生抵抗TGEV的黏膜和系统的免疫反应，免疫32天后就会产生抗体IgG、IgA,其抗体滴度分别为8.38+0.19ng/ml(血清),64.82+2.9ng/ml(肠液)[12.]。
3.3、作为人干扰素α-2b基因达的载体
干扰素是细胞分泌的一类具有抗病毒，抗肿瘤及免疫调节功能的蛋白质家族，将人干扰素α-2b基因克隆到乳酸杆菌表达载体pSC111AE质粒，将其转化德氏乳酸杆菌DM8909，获得了分泌表达hIFNα-2b的菌株，期望基因工程改造后的DM8909益生菌制剂不仅保持对细菌性阴道炎，滴虫炎的治疗作用，而且能预防和治疗阴道及外阴的病毒感染[13]。
3.4、降钙素基因的克隆
降钙素(Calciton5n，CT)是由32个氨基酸组成的多肽，有调节钙磷代谢的作用，在人医临床中已被用于治疗各种类型的骨质疏松症。在所有天然降钙素中，鲑、鲤和鸡的生物学活性最高，而人降钙素和猪降钙素的活性最低，且在体内易于降低，因此，目前人医临床中以鲑降钙素的应用最为广泛。首先将该基因连接到以ThYA基因为选择压力的非抗性表达载体pW425t中，转化TyA基因缺陷的大肠杆菌x5l。用SacI和如KpnI双酶切法和PCR法筛选出阳性重组质粒，然后采用电穿孔法将阳性重组质粒pWCT转化到ThyA基体缺陷的乳酸杆菌中。用PCR法筛选阳性重组质粒，并进行序列测定。结果表明,目的基因所编码的氨基酸序列与天然鲑降钙素的氨基酸序列完全一致。从而得到了含降钙素基因的重组乳酸杆菌[14]。
3.5、HIV疫苗载体
美国研究人员最近提出可利用经基因工程技术改造过的乳杆菌研制阴道栓剂，这种栓剂可以成为杀灭或抑制HIV的“化学避孕套”，从而协助妇女预防HIV感染。 最近，美国研究人员对妇女阴道粘膜内的天然生物学屏障―乳杆菌进行基因工程改造后移入阴道中，以抵抗HIV的入侵。Peter Lee认为在所有的女性容易发生HIV感染的位置――阴道内都有一种能够抗击HIV入侵的乳杆菌存在，它们能够分泌出具有抗菌、抗病毒作用的化学物质乳酸和过氧化氢。为查明是否可以将这种具有杀灭病毒作用的乳杆菌应用于临床，加州Osel公司的分子生物学家John Lewicki与Lee等选取女性阴道粘膜中天然存在的詹氏乳杆菌（Lactobacillus jensenii），将编码CD4蛋白的基因插入到该菌中。其机制主要是CD4是人体免疫细胞的一种膜蛋白，HIV在感染人体细胞之前需要先附着到CD4上。而经基因工程技术改造过的乳杆菌能分泌出CD4蛋白，从而抑制HIV与体内的自身的CD4结合而感染人体细胞。 这一方法既避免了药物在杀灭病毒时对阴道粘膜的损害，又可使细菌更有效地发挥抗HIV作用,帮助妇女减少HIV感染方面颇具前景。这项技术在体外实验中获得了成功，当与人类细胞培养物混合时，改造过的乳杆菌可将一种由实验室培养的HIV－1病毒株的感染力降低95%。Lewicki和Lee目前正在尝试通过基因工程技术，使CD4可以在乳杆菌表面表达，从而提高这一技术的有效性。他们表示，这样改造后的乳杆菌能结合HIV，用其分泌的乳酸和过氧化氢杀死病毒。研究小组希望最终能将改造过的乳杆菌浓缩于阴道栓剂中，应用于临床[15]。
3.6、鸡球虫病疫苗
鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道上皮细胞引起的一种原虫病。它广泛分布于世界各地，是目前危害养鸡业的重要疾病之一。目前，鸡球虫病的防治方法主要还是通过化学药物和免疫预防，但这两种方法都存在缺陷性：抗球虫药物的广泛使用，使耐药性虫株相继出现，研制新药费用又很昂贵；免疫预防容易引起免疫鸡体重下降和免疫不整齐现象。所以这给球虫病的防治带来了很大困难，人们迫切期望找到更好的防治球虫病的手段。
研究根据乳酸菌的生理功能和球虫的生物学特性, 王春风等人利用乳酸菌非抗生素抗性载体表达系统pW425t，将球虫S07(鸡球虫子抱子顶复合器折光体保护性抗原基因，表达大小为22．4Kda的保护性蛋白)基因在从健康鸡肠道中筛选的ThyA(胸腺哦暖核苦酸合成酶)基因缺陷型的嗜酸乳杆菌LaSl07中进行了表达，并将这种转球虫S07基因的功能乳酸杆菌给刚出壳的雏鸡伺喂，再人工攻击球虫，来模拟球虫的“带虫免疫”状态。通过对试验雏鸡的体重指标的检测，转球虫肋SO7基因工程乳酸菌能模拟球虫的“带虫免疫”状态，达到无虫的带虫免疫目的[16]。
4、其它方面的研究及应用
孙艺平等人进行了热芽孢杆菌SOD基因的克隆: SOD基因可在乳酸杆菌中表达，应用电穿孔将SOD基因转入乳酸杆菌，获得SOD基因的嗜酸乳杆菌，这样的乳酸杆菌具有抗氧化的作用,可应用于食品,化装品等方面; 广州医学院呼吸病研究所呼吸内科采用基因重组和生物工程技术，构建以乳酸杆菌为载体构的新一代脱敏用尘螨疫苗,此外还可用于研制抗疟原虫、吸血虫、弓形虫等寄生虫疾病的疫苗; 哮喘免疫治疗：研究开发重组BCG生物制剂用于支气管哮喘的治疗[17]; Lorenzo Nissen等人将山梨醇-6磷酸钠P32脱氢酶基因克隆到Lb.casei中在乳糖操纵子作用下表达，人工合成山梨醇，从而可以合成一些泌尿系统药物（如利尿药、脱水药等）[18]；瑞典卡罗林斯卡(Karolinska)研究所证明基因改造的乳酸杆菌可产生抗变形链球菌抗体, 从而杀灭某些致龋菌，有助于预防龋齿, 通过实验，研究人员给小鼠补充经过基因改造的乳酸杆菌，使其产生抗变形链球菌抗体，而正是人类口腔中的变形链球菌将糖类转化成为对牙釉质有腐蚀作用的乳酸，从而导致龋齿发生。经过这种治疗的小鼠口腔中变形链球菌数量大幅度下降，其龋齿发生明显减少。这种经过基因改造的乳酸杆菌可以在小鼠的口腔中持续存在，是一种可靠的预防和治疗龋齿的好方法。因此经常被作为口腔疫苗的载体[19]; 此外咯德乳酸杆菌可作为疫苗携带者, 咯德乳酸杆菌可从动物的肠道分离得到，它可分泌一种抗菌物质- 咯德因（Chung. Et. Al.1989）,本菌涂在肉品上，可抑制腐败菌的生长及降低挥发性氮的蓄积，而得以延长肉品的有效期，直接施用于肉制品，可有效抑制大肠杆菌及单核球增生性李斯特杆菌等病原菌，除此之外，本菌可治疗小孩病毒性肠胃炎，小孩急性下痢等，因此，若能开发咯德乳酸杆菌疫苗携带者，使其携带病原菌之部分缺损肠毒素基因或表面构造基因，由这些基因产物刺激肠道免疫防治，而达到保护动物免受该病原菌伤害的免疫效果。Pouwels等人（1996）成功地将含有感冒病毒抗原决定位(antigenic determinants)的核酸片段转移到咯德乳酸杆菌(Lactobacillus casei)内，并顺利观察到被刺激的口黏膜免疫反应及保护作用[20]。
5、存在的问题和发展前景
近年来，乳酸杆菌基因工程研究进展很快，而且取得了显著的经济效益和社会效益，但是要更好的开发乳酸杆菌基因工程还存在一定的难度，这主要表现在：乳杆菌中大部分质粒尤其是小质粒均属隐蔽型的，对这种质粒的功能知之甚少，因此对开发乳酸杆菌质粒载体造成了一定困难；作为革兰氏阳性菌，乳酸杆菌基因工程的难点在于其胞膜难以裂解，一般情况下，裂解大肠杆菌只需1 SDS即可，葡萄球菌、链球菌等革兰氏阳性菌则需用5～10 mg／mL溶菌酶预处理1h，而在一般培养条件下生长的乳酸杆菌需用lO mg／mL溶菌酶处理更长时间才可引起细胞膜的破裂，这主要是由于它的细胞壁成分肽聚糖分子中有75%的亚单位纵横交错连接，而革兰氏阴性菌只有30%，因此形成了紧密编织，质地坚硬和机械性很大的多层三维空间结构；很多实验说明了乳酸杆菌疫苗能够诱导全面的免疫应答，尤其是黏膜免疫，但是目前乳酸杆菌只能表达少数的抗原，而对于其它大多数抗原的表达还需要研究；目的基因在乳酸杆菌中的表达效率还有待提高，这可能由于乳酸杆菌在正常情况下以乳酸为其重要产物，外源蛋白的表达将与乳酸的产生形成多方面的竞争，故在常用的乳酸杆菌中，外源蛋白的表达受乳酸形成的影响，不能获得高表达，因此为提高目的基因的表达效率，选择合适的启动子及SD序列以提高转录水平；解决密码子的偏爱性；增强目的蛋白对胞内、胞外蛋白酶的耐受性，防止胞内、外蛋白酶对目的蛋白的降解，选择外泌蛋白酶较少的菌种，并使目的蛋白分泌出细胞；增加表达体系的稳定性；优化培养条件等都有待于解决；乳杆菌诱发免疫反应的机制还不清楚；与乳杆菌作为载体制成的活疫苗侵染性不强，只能诱导机体产生极低水平的抗体。因此，在以后乳酸杆菌基因工程的研究中还有许多值得改进的地方[2、21]。
与其它细菌(如大肠杆菌)的基因工程相比，乳杆菌的基因工程还不成熟、不完善尚处于开发阶段，还有很多问题有待解决，但是与乳酸杆菌作为受体菌生产氨基酸、酶、抗体、生理活性因子等，大大推动了畜牧业的发展，给人类展示了美好的发展前景，乳杆菌基因工程的发展还是具有深远意义的。乳酸杆菌的菌株具有不同的佐剂特征，对免疫系统有不同的影响，能够把免疫佐剂和目的抗原传给APCs的作用有效联合起来对免疫系统进行调节，许多研究表明，L.casei、L.plantarum、L.reuteri、L.johnsonii等菌株在此方面有可观的发展前景。此外乳杆菌能从长期的抗原刺激和高抗原荷载两方面激活宿主黏膜表面的淋巴细胞，在宿主内定居，能够较好的刺激TH1和TH2反应，最主要的是它安全、无毒，与其它外源蛋白的载体相比，大多数乳酸杆菌的表层都含有单一的、晶状的蛋白结构覆盖在整个细胞的表面，这些结构可分泌蛋白，因此可作为分泌型表达载体，弥补了其它表达载体的缺点，基于乳杆菌自身的一些优点，决定了它将成为一种很具有吸引力的微生物工具，成为新型的、安全的、发展前景广阔的疫苗[3]。