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甲基化特异性PCR全程易出现的问题与控制措施

(2010-03-24 22:22:39)
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杂谈

一、亚硫酸氢钠修饰过程中可能出现的问题及应对措施

亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶,而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP扩增失败,体会如下:

(
1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0~3.9 mol/L为好,其pH值必须用NaOH精确调整至5.0;

(2)修饰时间应掌握在10~16 h,修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧,而时间过短会导致修饰不彻底;

(3)反应温度应控制在50~55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好);

(4)DNA模板量应控制在<2ug为宜。

只要遵循以上几点基本上能保证99% 未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。但是,此修饰过程中模板DNA有约96%已经降解 。当DNA样品较少时(如石蜡包埋组织、血清DNA),在纯化回收时可加人适量鲑鱼精DNA或糖原(约1 g)作为载体,有利于DNA沉淀(加入载体后轻轻晃动Ependof管可见絮状DNA富集现象) 。


二、甲基化特异PCR可能出现的问题与对策

1.引物因素分析MSP的引物设计的质量是扩增成败的关键性因素。
MSP的引物设计与普通的PCR引物设计不同,MSP的引物设计原理是:模板DNA在经过亚硫酸盐处理后,发生甲基化的基因启动子区域CpG岛内CpG位点5 一端胞嘧啶保持不变;而未发生甲基化的CpG岛内CpG位点5 一端胞嘧啶转化为尿嘧啶,即C—U。针对修饰前后的序列差异用MethPrimer软件设计甲基化与未甲基引物,进行PCR扩增。MSP的引物序列中至少含有1个以上CpG位点,最好是含有多个CpG位点,这样可保证引物的特异性,同时可以提高DNA启动子甲基化碱基的检出率。MSP的引物必须按亚硫酸氢钠处理后的DNA序列设计,同时也应该尽可能与普通PCR的引物设计原则相符合。按MSP的要求,任意DNA序列在做MSP扩增时,至少要合成2对引物,即甲基化引物与未甲基化引物。在MSP的未甲基化引物序列中前导引物不含鸟嘌呤碱基,反向引物不含胞嘧啶碱基。初涉及MSP者最好用文献引物进行研究。如果是为了筛选新的甲基化的抑癌基因而文献中无法找到的相应MSP引物,可用在线MethPrimer软件在线设计引物,网址为http://www.urogene.org/methprimer/index1.html。根据软件提示可以找到所需要的MSP引物。但MSP所遇到的困难是,要扩增的是启动子或部分第一外显子序列,其CG含量相对较高,MSP扩增难度加大,因此设计好的引物最好用引物软件如Primer5.0从理论上推测其扩增效率,对于扩增效率<30% 的引物要进行优化,方法是:在核心启动子区域前后反复调整甲基化前导引物扩增起始点,以期使引物扩增效率增高,降低扩增难度,从而提高PCR产量。

2.MSP的反应体系问题MSP的反应体系的成分与普通PCR一样,反应体系的优化也与普通类似,反应体系的优化与普通PCR的反应体系中最大的区别是DNA模板不同。经过修饰后的模板为单链状态,MSP的DNA模板在抽提后应检测其纯度和含量,其纯度要求A260/A280在1.8~2.0之间;其含量要准确检测,否则在亚硫酸盐处理时因DNA模板加的太多而导致DNA处理不完全而导致MSP扩增失败;而加的DNA模板太少则一方面浪费试剂,另一方面会因为目的片段太少导致MSP假阴性。Mg“浓度一般在2.0~2.5 mmoL/L为宜,过低过高都不利于扩增。此外,PCR的缓冲液及Taq酶的来源也很重要,一般的PCR缓冲液常常会导致结果不稳定,不同来源的Taq酶也会影响结果的重复性。我们建议用Taka—ra公司针对富含CG等复杂二级结构模板的TaKaRa IATaq with GC Buffer效果较好。而一旦选用某一厂家Taq酶后,不要轻易更换,以免MSP因重新优化而引起的时间和成本的浪费。

3.MSP的反应温度分析MSP扩增的结果有3种情况:(1)产物电泳为阴性;(2)产物电泳出现多条非特异性条带(含目的基因条带);(3)产物电泳为阳性(仅目的基因条带)。出现前2种情况时,可在保证反应体系和引物没有问题的情况下,通过调整MSP的反应温度而得到目的基因带。方法如下:PCR反应中,Tm的高低与CG含量呈正相关。因甲基化与未甲基化引物序列差异,在扩增过程中可能会出现PCR偏性。我们建议,提高预变性温度(一般应>95。C,10 rain)和变性温度(>95℃ ,1 min),退火温度以60℃作梯度或70℃作降落PCR。

总之,在MSP全过程中,影响结果的因素较普通PCR要多得多,只要对实验过程每一步认真控制可完全提高MSP的准确度和精密度。

对于该文章的一些观点,我也提出一些意见和大家讨论。

(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0~3.9 mol/L为好。(我们实验室就答亚硫酸盐就大于这个浓度)

(2)修饰时间应掌握在10~16 h,修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧,而时间过短会导致修饰不彻底。(这点我深有体会,因为如上所述,我当时也怀疑4h可能修饰不完全,分别就做了6h,12h,16h.确实发现修饰时间过长,模板破坏加剧,可能不倒2个星期就降解了,当时P处M的,后来居然只能P出U.

(4)DNA模板量应控制在<2 g为宜。(这个我想大家应该都理解,主要是为了修饰完全)

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