溶血与凝聚检查法
本法系将一定量的对照品或供试品与2%的兔（或羊）红细胞混悬液混合，温育一定时间后，观察其对红细胞状态是否产生影响的一种方法。
1 2%红细胞混悬液的制备 取兔（或羊）血数毫升（约20ml），放入含玻璃珠的锥形瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入0.9%氯化钠溶液约10倍量，摇匀，每分钟1000～1500转离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9%氯化钠溶液按上述方法洗涤2~3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9%氯化钠溶液配成2%的混悬液，供试验用。
2 凝聚反应阳性对照物的配制 于临用前称取适量明胶（粘度≥15Pa），以0.9%氯化钠溶液为溶剂，置沸水浴中充分溶解后配制成3%的溶液。
3 供试品溶液的配制 除另有规定外，临床用于非血管内给药的注射剂，以各药品使用说明书规定的临床使用浓度，用0.9%氯化钠溶液1：3稀释后作为供试品溶液；用于血管内给药的注射剂以各药品使用说明书规定的临床使用浓度作为供试品溶液。（用临床使用浓度我认为不合适。该限值制定应该在正文中表述。）
4 检查法 取洁净试管8只，编号，1、2号管为供试品管，3、4号管为阴性对照管（0.9%氯化钠溶液），5、6号管为溶血阳性对照管（蒸馏水），7号管为凝聚阳性对照管（明胶），8号管为供试品对照管。按下表所示依次加入2%红细胞悬液、0.9%氯化钠溶液、蒸馏水、3%明胶或供试品溶液，混匀后，立即置37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育。3小时后观察溶血和凝聚反应。
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试管编号 |
1、2 |
3、4 |
5、6 |
7 |
8 |
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2%红细胞悬液/ml |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
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0.9%氯化钠溶液/ml |
2.2 |
2.5 |
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4.7 |
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蒸馏水/ml |
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2.5 |
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3%明胶/ml |
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2.5 |
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供试品溶液/ml |
0.3 |
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0.3 |
4.1 溶血
4.1.1 肉眼观察法 取上述温育后的1、3、5、8号管肉眼观察上清液的颜色，如试管中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液无色澄明，或上清液虽有色澄明，但1号管和8号管比色无显著差异，则表明肉眼观察无溶血发生。
4.1.2比色法 若肉眼观察上清液不能判定是否有溶血发生时，则将各管以每分钟1500转离心10分钟，取上清液在分光光度计上，545nm处进行比色，以0.9%氯化钠溶液为空白读取各管的吸光度值（OD），以下列公式计算溶血百分率：
溶血百分率（％）＝（ODt－ODnc）/(ODpc－ODnc) ×100％
式中：ODt：供试品溶液管吸光度值；
ODnc：阴性对照管吸光度值；
ODpc：溶血阳性对照管吸光度值。
若溶血百分率小于5%则表明无溶血发生。
4.2 凝聚
4.2.1 肉眼观察法 取上述温育后的2、4、6、7号试管肉眼观察，若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，用吸管轻轻吹打5-10次后不分散，表明有红细胞凝聚发生，能均匀分散者为假凝聚。
4.2.2 显微镜法 若肉眼观察不能判定是否有凝聚发生时，则将吹打后含有凝聚物的红细
胞混悬液取一滴于玻片上，再加2滴0.9%氯化钠溶液混匀后加盖盖玻片，置显微镜下观察（20-40倍），凝聚红细胞能被冲散，并且红细胞呈单个散在状态者为假凝聚；若凝聚物不被冲散并出现类似阳性对照管一样的状态，即为凝聚，根据下表判定红细胞凝聚程度并分级。
红细胞凝聚程度与分级表
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检查法 |
0级 |
Ⅰ级 |
Ⅱ级 |
Ⅲ级 |
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肉眼观察法 |
未见絮状沉淀，分层不明显 |
少量絮状沉淀，分层不明显 |
明显棕红色或红棕色絮状沉淀，分层明显 |
严重凝聚，红细胞全部沉入管底，上清液澄明且吹打后不能完全分散 |
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显微镜法 |
任一视野均未见红细胞凝聚，红细胞呈单个散在状态 |
视野中有少量红细胞二三个粘集在一起或呈串状 |
视野中有大量红细胞粘集在一起 |
红细胞凝聚严重，即见到大量的红细胞堆积在一起、呈片状 |
5 结果判断 当阴性对照管无溶血和凝聚发生，溶血阳性对照管有溶血发生，凝聚阳性对照管有凝聚发生时，若供试品管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚，判定供试品符合规定；若供试品管的溶液在3小时内发生溶血和（或）凝聚，判供试品不符合规定。
起草单位：海南省药品检验所
参加单位：中检所、辽宁省药品检验所、山西省药品检验所、湖北省药品检验所
