加载中…第十节 抗菌肽研究进展
抗菌肽(antibacteial peptides)又叫抗微生物肽(antibacteial peptides)、多肽抗生素(peptide antibiotics)，是指氨基酸数目小于100，常带正电荷，并且具广谱抗性的一类小肽。它是生物体内产生的一具有强抗菌作用的阳离子多肽，是生物先天免疫的重要组成成分。在近20多年里，抗茵肽的开发和应用已成为研究的热点，在动植物转基因工程及药物开发领域具有广阔的应用前景。本文就抗茵肽的特性、来源与分布、结构与分类、功能，作用机理以及应用前景等方面加以论述。
抗菌肽(antibacteial peptides)又叫抗微生物肽(antibacteial peptides)、多肽抗生素(peptide antibiotics)，是指氨基酸数目小于100，常带正电荷，并且具广谱抗性的一类小肽。它是生物体内产生的一具有强抗菌作用的阳离子多肽，是生物先天免疫的重要组成成分。
继1980年在美国天蚕体内发现了第一个动物来源的抗生素多肽-杀菌肽(Cecropin)以来，在昆虫、两栖类、水产动物、包括人在内的哺乳动物甚至植物及细菌等广泛的生物谱中发现了至少1700余种抗菌肽，它们构成了宿主抵抗外来病原菌感染的第一道防线。
一、抗菌肽特性
如此繁多的抗菌肽有其共同的特性：
① 微量抗菌谱广(包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、寄生虫)，同时有抗某些带包膜病毒的作用，甚至可杀伤肿瘤细胞，但大多数抗菌肽对正常真核细胞无毒性或低毒性，且几乎无耐药性；正因如此，抗菌肽亦被称为“天然的抗生素”，因其有望克服日益严重的抗生素耐药问题而引起了人们极大的兴趣；
②分子质量小，3．97ku左右，多由l5～45个氨基酸残基组成，N端为碱性氨基酸残基，大多带正电荷，具有两亲结构；
③除少数外，均由基因编码在核糖体直接表达，呈分泌性表达，可快速诱导，正如Boman所言，抗菌肽因其快速合成机制成为理想的第一道防线：首先，抗菌肽比免疫球蛋白M(IgM)的合成快100倍；此外，短肽要比大分子蛋白和免疫细胞的弥散速度快的多；
④热稳定好；
⑤作用靶点为细胞膜。
二、抗菌肽分类
Boman将抗菌肽分为如下5类：
①线性螺旋性抗菌肽，不含Cys，目前此类成员最多，杀菌肽、滑瓜蟾素(Magainins)属于此类；
②不含Cys的抗菌肽，但在其结构中有1或2个氨基酸残基(Pro-Arg，Trp或His)反复出现，如PR-39、Indolicidin和Hismtins；
③ 含1个二硫键的抗菌肽，目前此类成员最少，此类中牛Dodecapeptide、蛙Brevinins和Esculentin研究的较清楚；
④含2个或更多个二疏键的抗菌肽，多为β-片层结构，如防御素(Defensins)；
⑤来源于具有其他功能的大分子蛋白的抗菌肽，如Lactoferricins是Lactoferrin的消化产物。
三、抗菌肽的来源和分布
3．1 哺乳动物抗茵肽
哺乳动物抗菌肽主要存在于中性粒细胞及皮肤和黏膜的上皮细胞。哺乳动物抗菌肽主要分为两大类，即防御素(defensins)和cathelicidins。前者含有6个保守的半胱氨酸(Cys)，形成3个分子内二硫键；而后者是由于均含有保守的cathelin区域(猪半胱氨酸蛋白酶抑制子)而得名。其中研究最多的防御素类抗菌肽，是抗菌肽家族最大的一类。已从脊椎动物中发现了100余种防御素，哺乳动物防御素分为α-defensins和β-defensins两大类。
3．2 禽类抗茵肽
目前，国内外学者已从鸡、火鸡、鸵鸟血液的中性粒细胞以及企鹅的胃内容物内分离出抗菌肽。禽类抗菌肽具有defensins抗菌肽家族的典型特征，其分子具有6个半胱氨酸残基形成3个二硫键，而且家禽体内只存在β-defensins。禽类β-defensins分为两类：第一类包含有63个～64个氨基酸残基组成的前肽和不足1．6 kb的内含子；第二类包含有68个～69个氨基酸残基组成的前肽，比第一类多6．5 kb内含子。
3．3 两栖动物抗茵肽
自1962年Kiss和Michal在铃蟾皮肤分离出由22个氨基酸组成的铃蟾抗菌肽(bombinin)至今，人们已从600多种两栖动物皮肤分离出100多种抗菌肽。两栖动物抗菌肽主要存在于皮肤的粒腺、胃黏膜和小肠细胞，它们的氨基酸序列几乎无同源性，分为双亲性α-螺旋结构和环状结构两种。不同种类的蛙可以产生多种抗菌肽，它们既无序列相似性又与爪蟾抗菌肽Magainins不同。
3．4 昆虫抗菌肽
1980年，Boman H 等首次从惜古比天蚕(Hyatophora cecropia) 中诱导发现天蚕素(cecropin)抗菌肽至今，现已发现170多种昆虫抗菌肽。昆虫的免疫防御体系中，没有抗体、补体的参与，主要是由一系列抗菌肽发挥作用，多数是由脂肪体合成后释放入血淋巴中，但也有少数是在特定区域表达的；昆虫还能根据不同的病原菌产生不同的抗菌肽。
3．5 植物抗茵肽
植物抗菌肽主要存在于叶子、种子、胚和子叶中。植物抗菌肽都富含半胱氨酸(Cys)，并且所有的半胱氨酸都形成分子内二硫键。
3．6 细菌抗茵肽
抗菌活性肽通常与由细菌和真菌产生的抗生素肽和抗病毒肽联系在一起，包括环形肽、糖肽和脂肽，如短杆菌肽、杆菌肽、多黏菌素肽和乳酸链球菌肽等细菌素是最常见的一类细菌抗菌肽，它能特异性杀死竞争菌而对宿主本身无害。Lantibiotic是革兰氏阳性菌产生的抗菌肽，乳链菌肽是其中研究最为清楚的Lantibiotic类抗菌肽。革兰氏阳性菌产生的细菌素大部分是肽，多数为阳离子和两性分子，并来源于前肽，具广谱抗菌活性，广泛用作食品保藏剂以及抗感染药。革兰氏阴性菌产生的细菌素大部分是分子质量较大且具有功能区的蛋白质毒素，具有受体介导的窄谱抗菌活性。
3．7 病毒抗茵肽
HIV-1包膜蛋白胞质尾部是最早发现的病毒抗菌肽，它们同从其他慢性病毒穿膜蛋白得到的抗菌肽一样，都有抗菌活性和细胞毒作用。所有的病毒抗菌肽都富含精氨酸而不含赖氨酸。
四、抗菌肽的结构和功能
4．1 抗菌肽的结构
杀菌肽(cecropin)含31～39个残基(无半胱氨酸)，有α-两性螺旋区域，使它能渗透性杀死G-菌和G+菌。防御素(defensin)是哺乳类抗微生物肽的主要成员。根据空间结构的不同，人和哺乳动物的防御素可以分为三类：α-防御素，β-防御素，θ-防御素。它们都为小分子多肽，长18～42个氨基酸，含6个半胱氨酸，形成3对分子内二硫键，为阳离子。α-防御素首先从哺乳动物粒细胞颗粒中发现的，它的三对分子内半胱氨酸-s-s-键位于C1～C6、C2～C4、C3～C5。β-防御素的-s-s-键位于C1～C5、C2～C4和C3～C6，它起初发现于牛的呼吸道上皮细胞，后又报道了许多其他动物和其他如舌、结肠上皮细胞的β-防御素。α-防御素和β-防御素基因密码位于8号染色体短臂第2区第3带(8p23) 数百个碱基对片段上。θ-防御素是最近从恒河猴嗜中性粒细胞(90％)和单核血细胞中分离的一种环状抗微生物肽，它含18个氨基酸残基，巨环，3对二硫键，为环状抗微生物肽，环状多肽的杀菌活性3倍于打开链的类似多肽。蛙皮肽(magainin)有21～27个残基，不存在半胱氨酸，以同基因多蛋白前体形式在体内合成，前体蛋白切开成几个片段，导致成熟肽产生。它形成两性α-螺旋结构，向下一端呈疏水性，而另一端是亲水性，与杀菌肽天蚕素(cecropin)的结构类似。蜂毒素(melittin)是由26个氨基酸组成，分子中有5个碱性氨基酸，其中4个集中在肽段的C端(KRKR)，它对G-菌和G+菌都有很强的抑制作用。
4．2 抗菌肽的功能
动植物体每天要与环境中几百万种的病原菌接触，随时都有被感染的可能，单单依靠病原的特异性免疫应答是远远不够的，因为它们的反应速度非常慢，大致需要7 d的时间，所以大自然就选择了速度很快且具有广谱抗菌活性的抗菌肽。抗菌肽可以抑杀多种细菌和真菌(包括对抗生素产生耐药性的突变种)，它们还可以杀死某些寄生虫，甚至对含包膜的病毒都起作用。抗菌肽是非专一性的免疫应答产物，微生物和其他一些理化因素均可以诱导昆虫产生抗菌肽，免疫诱导源可以是非专一性的，不同的诱导源作用后，都可以在动物的血淋巴中检测到相同的抗菌肽。
从一些动物模型的实验结果可以看到，当宿主感染病原菌时，体内抗菌肽的数量会相应增加，如当猪感染沙门菌时，体内的cathelicidin的表达量会比平时增加3倍；牛感染似隐孢菌时，肠防御素的含量会提高5倍；鼠在烧伤部位会产生D4B防止绿脓杆菌致死效应的发生。虽然无法在人体内做实验，但从一些疾病患者的生理反应中可以看到类似的结果，如在感染肺炎球菌的患者，他们的细胞质中Hbd-2的表达量增加4倍。
抗菌肽在宿主的防御体系中除了能直接杀死病原菌外，还具有其他一些功能：可以促进化学因子的表达和T辅助淋巴细胞的增殖反应；可以充当单核细胞和T淋巴细胞的趋化因子，使它们能在炎症反应部位迅速聚集；抑制细菌产物(如脂多糖、脂壁酸)诱导产生对宿主有害的细胞因子，避免内毒素血症的产生；促进巨噬细胞及激活的淋巴细胞的凋亡。
五、抗菌作用机理
5．1 α-螺旋型抗茵肽
研究表明，α-螺旋肽如昆虫cecropins，通过其两亲性α-螺旋上的正电荷与细菌细胞膜磷脂分子上的负电荷之间因静电吸引而结合在细胞膜上，再借助于其分子中N端和C端间连接结构的柔性，抗菌肽分子中的疏水端插入到细胞膜中，然后两亲性的α-螺旋也插入到细胞膜中，这样就破坏了脂质双层原来的有序结构。由于α-螺旋具有两亲性，所以抗菌肽分子通过膜内分子间的位移而相互聚集在一起，从而在膜上形成离子通道，使细菌因不能保持正常的渗透压而死亡。
5．2 β-折叠型抗茵肽
β-折叠肽如哺乳动物防御素，其杀菌机理类似于Ceeropins在膜上形成离子通道，即离子通道在抗菌活性中起着重要作用。亦有人提出假设，认为一些抗菌肽分子作用于细胞膜蛋白引起凝集、失活及离子通道的破坏，导致膜的通透性改变而使细菌死亡。另有人提出有些抗菌肽分子(如PR-39)通过影响细胞膜上的能量转运和代谢，从而损伤细胞呼吸链的功能而杀死细菌。抗菌肽还可以断裂癌细胞的核DNA，通过抑制DNA的合成而杀死癌细胞。总而言之，抗菌肽作用机理的关键在于通过物理方式和细胞膜发生作用，不同类别的抗菌肽其作用机理可能不同。
5．3 抗茵肽作用机理的特点
(1)作用部位的有效性。传统抗生素是通过消除微生物生长或生存必需的功能，如阻挠细菌蛋白质的合成或者改变酶的活性来达到杀菌目的，而细菌通过改变一种基因就足以对付抗生素的这种进攻。抗菌肽则作用于细菌细胞膜，导致膜的通透性增大，以此穿透、杀灭细菌。细菌必须改变膜的结构，即改变相当部分的基因才能防御抗菌肽的进攻，而这几乎是不可能的。因此，抗菌肽极大地减少了产生耐药性的可能。
(2)作用对象的选择性。抗菌肽只对原核生物细胞和真核生物病变细胞有抗菌作用，对正常的真核生物细胞不起作用口 。原因在于原核生物和真核生物的细胞膜结构不同，真核细胞膜中含有大量的胆固醇，而胆固醇的存在使膜结构趋于稳定。此外高等动物存在高度发达的细胞骨架系统，其存在也抵抗了抗菌肽的作用。癌细胞的细胞骨架系统与正常细胞相比不发达，这是抗菌肽对其产生抑制作用的原因之一。
六、抗菌肽的应用现状、存在问题及前景
6.1 应用现况
目前，抗菌肽在农业、医药、食品和化妆品等领域已经有了一定的应用实践并取得了较好的效果。
（1）农业领域。抗菌肽成分为易消化吸收的氨基酸，可作为畜禽饲料添加剂取代或部分取代目前饲喂动物所用的抗生素，减少抗生素对动物体的危害。目前广东省应用抗菌肽基因转化酵母进行高效表达，经发酵条件优化，生产抗菌肽酵母制剂，用作畜禽及水产饲料添加剂，代替抗生素预防及治疗仔猪白痢和雏鸡白痢有明显效果。
（2）医药领域。有研究表明，抗菌肽对流感病毒、疱疹病毒、乙型肝炎病毒等也有抑制作用。另有报道，一些抗菌肽在亚毒性浓度下可抑制艾滋病毒HIV-1的基因表达。抗菌肽能特异性抑制某些肿瘤的生长，对人体正常细胞无害，极有可能成为无毒或低毒的抗肿瘤新药。
（3）食品和化妆品领域，如从乳酸菌中分离的抗菌肽细菌素，可抑制食品中的各种病原微生物的生长而作保藏剂。抗菌肽在化妆品上用作防腐剂，鱼类抗菌肽不仅是营养成分，更重要的是它的抗菌和美容作用，比化学防腐剂用于化妆品具有独特的优势和广泛的市场潜力。
6.2 存在的问题及前景
由于抗菌肽的分子小，所以直接从动植物组织中提取天然抗菌肽时，分离提纯存在一定的困难，故化学合成和基因工程法成为获得抗菌肽的主要手段。但是化学合成抗菌肽成本高，而通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因，由于抗菌肽分子小，易被蛋白酶降解，而且表达产物可能对宿主有害，从而影响了基因的高水平表达。如何提高生产效率、降低成本成为抗菌肽基因工程研究亟待解决的问题。另一方面，与传统抗生素相比，某些抗菌肽的抗菌活性还不够理想，改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是提高其活性的有效途径。这就需要进一步研究抗菌肽的结构与活性之间的关系，为抗菌肽分子的改造和设计提供足够的理论依据。
随着对抗菌肽结构与作用机理的不断深入研究，上述一系列问题必将得到解决。新型、高效、低毒、广谱的抗菌肽在农业、医药、食品等领域将会发挥重要的作用，为人类创造更大的价值。
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