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拍打拉筋抗糖尿病机理研究简报/王锡宁

(2015-05-06 00:26:16)
标签:

拍打

拉筋

胰岛素

糖尿病

自愈法

分类: 公共事件

拍打拉筋抗糖尿病机理研究简报/王锡宁
声明:请媒体不要自毁长城

拍打拉筋抗糖尿病机理研究简报

 

“拍打拉筋刺激骨骼肌肉产生骨钙素修复胰岛细胞功能”机理研究简报

(简称:拍打拉筋抗糖尿病机理研究简报)

 

王锡宁/文

中国拍打拉筋临床研究课题组

2015/5/5

 

1、糖尿病患者的曙光

   

      糖尿病是人体胰脏β细胞分泌胰岛素功能减退,导致人体细胞不能正常吸收利用血糖提供能量,血糖大量在血管内堆积使人口渴尿多,使劲喝水小便,细胞严重缺糖能量不足使人饥饿难忍,吃饭越多人感觉越饿。典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现,即“三多一少”症状。

     现在糖尿病的主要治疗方法是:制药厂从动物体内加工提取或使用生物技术人工合成外源性药用“胰岛素”,给糖尿病病人注射,补充病人体内自我生产胰岛素的不足,病人需要终生用药。是否有一种方法可以不用药物治疗糖尿病呢,为此全世界的科学家都在努力探索。

     美国哥伦比亚大学的杰拉德·卡若森蒂(Gerard Karsenty)教授和其研究小组率先发现,造骨细胞确实藉由内分泌系统调控其它组织的生理状态,而骨钙素可能就是直接参与其中的激素。 上述的结果发表于2007年8月的《细胞》(Cell)期刊上。论文称,骨细胞产生的一种蛋白骨钙素(BGP或OST)可影响小鼠β细胞增生、使胰岛素分泌增加及细胞对胰岛素敏感性增加。附加实验表明,骨钙素是通过脂联素(由骨骼肌分泌的另一种激素)调节胰岛素敏感性。 这项研究对传统的人体解剖学是一次革命性颠覆:传统解剖学认为,骨骼和骨骼肌只是普通的运动器官协助生命活动,而现在科学家已经认识到,“骨骼和骨骼肌其实是人体最大的内分泌器官主导生命活动”。美国哥伦比亚大学的杰拉德·卡若森蒂(Gerard Karsenty)教授和其研究小组的这项发现还有另外一个重要的临床意义是:他们向世界宣布,一种有生物学试验结果支持的临床治疗糖尿病的全新理论已经形成,他们预言不久的将来一种治疗糖尿病的全新方法即将诞生。

     我们的医疗情报系统是在2008年6月间获得这个来自科学研究前沿的关于糖尿病治疗原理的最新成果信息。这个信息对于糖尿病病人来说是一个天大的喜讯,全世界的糖尿病病人和全世界的科学家都在满怀信心关注和期待治疗糖尿病的新技术早日问世。

 

2、美国、韩国、法国、英国、加拿大五国专家合作研究结论

 

课题情报检索研究

检索思路:骨骼分泌骨钙素,可以刺激β细胞增生、胰岛素分泌和胰岛素敏感性的增加,可以改善糖耐量。

关键词检索:骨钙素、脂联素、β细胞、胰岛素、糖耐量

研究目标:了解该课题相关的国际研究进展方向思路、应用及当前水平

论文题目:骨骼通过内分泌调节能量代谢

论文编号:DOI 10.1016/j.cell.2007.05.047

通信作者:Gerard Karsenty,*(杰拉德·卡若森蒂)

 

研究结论:通过脂源性激素调节骨质重塑意味着骨骼可能对能量平衡施加反馈控制。为了检验这一假设,我们寻找在造骨细胞中表达、编码信号分子和影响能量代谢的基因。我们发现,由于β细胞增生、胰岛素分泌和胰岛素敏感性的增加,缺乏蛋白酪氨酸磷酸酶OST-PTP的小鼠呈低血糖,免于肥胖和葡萄糖不耐受。相比之下,造骨细胞分泌的分子中缺乏骨钙素的小鼠呈β细胞增生、糖耐量和胰岛素抵抗力下降趋势。从缺乏OST-PTP的小鼠身上切下一个骨钙素等位基因就能纠正其代谢表型。在体外,骨钙素可以刺激β细胞以及脂肪细胞中的脂联素(增强胰岛素敏感性的脂肪因子)中的细胞周期蛋白D1和胰岛素表达;在体内,骨钙素可以改善糖耐量。这项研究通过揭示骨骼对糖稳态有内分泌调节作用,扩展了这一器官的生物学重要性,加强了我们对能量代谢的认识。

 

研究背景:骨骼通过内分泌调节能量代谢 //Gerard Karsenty(杰拉德·卡若森蒂)该项目课题是由美国、韩国【CHO-A制药公司资助】、法国、英国、加拿大,五个国家的专家合作研究完成。这跨国研究项目走的是基因技术路线并达到顶峰水平(2013年著名的 CNS 杂志影响因子分别为:Nature《自然》(38.597)、Cell《细胞》(31.957)、Science《科学》(31.027),《细胞》杂志的SCI影响因子是31.957,比美国《科学》(31.027)还要高,位居世界第2名)。该项研究的主要优势是建立在“拆分论”基础上的“技术深度”表述。我们拟计划采取相反的研究模型,从“整体论”和“技术广度”建立应用研究优势,我们计划成立或建立世界上最大规模的“物联网生物实验室”研究拍打拉筋与糖尿病的关系,建立在物联网标准治疗监测技术基础之上的全球10万人糖尿病患者拍打拉筋(大数据)研究报告,促进形成糖尿病治疗国际新标准,美国Gerard Karsenty 的基因研究将构成为我们项目“实验室阶段”的基础研究证据之一。

 

3、杰拉德·卡若森蒂(Gerard Karsenty)教授简历

 

美国哥伦比亚大学医学中心

拍打拉筋抗糖尿病机理研究简报/王锡宁

杰拉德·卡若森蒂

基因学与发展系教授和主席

 

地址:701 West 168th Street Room 1602A New York NY 10032

电话:212-305-6398

传真:212-923-2090

电邮:gk2172@columbia.edu

 

教育与培训背景:

1984年:毕业于法国巴黎第五大学,获医学博士学位

1987年:获美国国立卫生研究院(NIH)博士后奖学金

1990年:获美国德克萨斯大学MD 安德森(MD Anderson)癌症中心博士后奖学金

 

隶属关系(所在单位):

基因学与发展系研究生课程

分子、细胞与生物物理研究综合课题组

 

研究概述:创新骨架生理学

 

当前研究工作:

随着我们对发生在细胞和某个具体器官中的分子运作情况的了解不断深入,现在,脊椎动物生物学研究的一个基本问题是了解整个机体是如何作为一个单一、连贯、综合的单元运作的,也就是说,生理学是如何在整个机体层面运作的。要着手解决这一问题,我们运用了进化过程中最迟出现的器官(骨骼)作为工具,并提出如下问题:骨骼是否/如何影响其他器官和生理过程。为了解决这一问题,我们根据进化和医学方面的考虑因素制定了如下假说:骨骼生长、能量代谢和繁殖的控制必须是协调的。在研究这一假说的过程中,我们证明骨骼是一个内分泌器官,它能分泌出一种激素(骨钙素),可对广泛的各种功能产生重大影响:比如能量代谢、繁殖、学习和记忆功能。在生物体和分子级别的研究结果表明:骨骼可能不仅仅是老化的一个牺牲品,并且还可能通过骨钙素防止或延迟一系列主要生理功能的衰变。

我们将继续探索这一假说的各个方面,以确定我们发现的器官之间的通讯能否帮助我们更好地理解导致退行性疾病的病理生理机制。最终,我们的目标是运用这些知识提出针对退行性疾病的治疗方案。

 

出版物:

1、Lee NK,Sowa H,Hinoi E,Ferron M Ahn JD,Confavreux C,Dacquin R,Mee PJ,McKee M,Jung,DY,Zhang Z,Kim JK,Mauvais-Jarvis F,Ducy P和杰拉德·卡若森蒂(2007)

Endocrine regulation of energy metabolism by the skeleton

《骨骼通过内分泌调节能量代谢》

发表在《细胞》(Cell)杂志第130期,第456-469页。

 

2、Yadav VK,Ryu JH,Suda N,Tanaka K,Gingrich J,Schutz G,Glorieux FH,Insogna K,Mann JJ,Hen R,Ducy P和杰拉德·卡若森蒂(2008)

Lrp5 control bone mass by inhibiting serotonin synthesis in the duodenum.

《Lrp5通过抑制十二指肠内5-羟色胺合成控制骨的形成》

发表在《细胞》(Cell)杂志第135(5)期,第825-837页。

 

3、Yadav VK,Oury F,Suda N,Liu Z-W,Gao X-B,Confavreux C,Klemenhagen CK,Tanaka KF,Gingrich JA,Guo XE,Tecott LH,Mann JJ,Horvath TL和杰拉德·卡若森蒂(2009)

A serotonin-dependent mechanism explains leptin regulation of bone mass, appetite and energy expenditure.

《5-羟色胺依赖机制解释瘦素对骨量、食欲和能量消耗的调节作用》

发表在《细胞》(Cell)杂志第138(5)期,第976-989页。

 

4、Ferron M, Wei J, Yoshizawa T, Del Fattore A, De Pinho RA, Teti A, Ducy P和杰拉德·卡若森蒂(2010)

Insulin signaling in osteoblasts integrates bone remodeling and energy metabolism .

《造骨细胞中的胰岛素信号集成骨骼重塑和能量代谢》

发表在《细胞》(Cell)杂志第142期,第296-308页。

 

5、Oury F, Sumara G, Sumara O, Ferron M, Smith CE, Hermo L, Suarez S, Roth BL, Ducy P和杰拉德·卡若森蒂(2011)

Endocrine regulation of male fertility by the skeleton.

《通过骨骼对男性生育能力进行内分泌调节》

发表在《细胞》(Cell)杂志第144期,第796-810页。

 

6、Arteaga-solis E,Zee T,Emala C,Vinson C,Wess J和杰拉德·卡若森蒂(2013)

Inhibition of leptin regulation of the parasympathetic tone as a cause of extreme body weight-associated asthma.

《抑制副交感神经张力的瘦素调节是极端体重相关的哮喘原因之一》

 

Profile of Prof. GERARD KARSENTY

 

Columbia University Medical Center

 

GERARD KARSENTY

 

PROFESSOR AND CHAIR, GENETICS AND DEVELOPMENT

 

Address: 701 West 168th Street Room 1602A New York NY 10032

Phone: 212-305-6398

Fax: 212-923-2090

E-mail: gk2172@columbia.edu

 

Education and Training:

M.D., Ph.D. 1984, University of Paris V

Postdoctoral Fellowship 1987, National Institute of Health

Postdoctoral Fellowship 1990, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center

 

Affiliations:

Graduate Program in Genetics and Development

Integrated Program in Molecular, Cellular and Biophysical Studies

 

Research Summary: Novel Physiology of the Skeleton

 

Current Research:

With the growing molecular understanding of events occurring in cells or a given organ we have achieved, a fundamental question of vertebrate biology is now to understand how an entire organism functions as a single coherent and integrated unit, in other words how physiology operates at the level of the entire organism. To begin to address this problem we use as a tool the latest organ that appears during evolution, the bone and ask if and how it influences other organs and physiological processes. To address this question we formulated the hypothesis, based on evolutionary and medical considerations, that the control of bone growth, energy metabolism and reproduction must be coordinated. Exploring this hypothesis led us to demonstrate that bone is an endocrine organ secreting a hormone, osteocalcin, that influences functions as diverse and important as energy metabolism, reproduction, learning and memory. What emerges from this work conducted at the organism and molecular levels is that bone may not only be a victim of aging but may also prevent or post-pone decay of a series of key physiological functions through osteocalcin.

 

 

We are continuing to explore all facets of our working hypothesis, to determine if the interorgan communications we identify can lead to a better understanding of the pathophysiology of degenerative diseases. Ultimately our goal is to use the knowledge to propose adapted therapies for these diseases

 

Publications:

1. Lee NK, Sowa H, Hinoi E, Ferron M Ahn JD, Confavreux C, Dacquin R, Mee PJ, McKee M, Jung, DY, Zhang Z, Kim JK, Mauvais-Jarvis F, Ducy P, and Karsenty G : (2007) Endocrine regulation of energy metabolism by the skeleton.  Cell  130: 456-469

 

2. Yadav VK, Ryu JH, Suda N, Tanaka K, Gingrich J, Schutz G, Glorieux FH, Insogna K, Mann JJ, Hen R, Ducy P and Karsenty G: (2008) Lrp5 control bone mass by inhibiting serotonin synthesis in the duodenum.  Cell  135(5): 825-837

 

3. Yadav VK, Oury F, Suda N, Liu Z-W, Gao X-B, Confavreux C, Klemenhagen CK, Tanaka KF, Gingrich JA, Guo XE, Tecott LH, Mann JJ, Horvath TL and Karsenty G.: (2009) A serotonin-dependent mechanism explains leptin regulation of bone mass, appetite and energy expenditure.  Cell  138(5): 976-989

 

4. Ferron M, Wei J, Yoshizawa T, Del Fattore A, De Pinho RA, Teti A, Ducy P and Karsenty G: (2010) Insulin signaling in osteoblasts integrates bone remodeling and energy metabolism .  Cell  142: 296-308

 

5. Oury F, Sumara G, Sumara O, Ferron M, Smith CE, Hermo L, Suarez S, Roth BL, Ducy P and Karsenty G: (2011) Endocrine regulation of male fertility by the skeleton.  Cell  144: 796-810

 

6. Arteaga-solis E, Zee T, Emala C, Vinson C, Wess J and Karsenty G: (2013) Inhibition of leptin regulation of the parasympathetic tone as a cause of extreme body weight-associated asthma.  Cell  17(1): 35-48

 

查询:http://asp.cumc.columbia.edu/facdb/profile_list.asp?DepAffil=Genetics&uni=gk2172

 

 

4、《骨骼通过内分泌调节能量代谢//Gerard Karsenty》中文版译文

           备注:本文未经作者授权,翻译和发布仅供个人学习交流。

 

骨骼通过内分泌调节能量代谢

 

研究人员和其工作单位 (由美国、韩国【CHO-A制药公司资助】、法国、英国、加拿大,五国专家合作研究)

Na Kyung Lee,1 Hideaki Sowa,1 Eiichi Hinoi,1 Mathieu Ferron,1 Jong Deok Ahn, 3 Cyrille Confavreux,1 Romain Dacquin,4 Patrick J. Mee,5 Marc D. McKee, 6 Dae Young Jung, 7 Zhiyou Zhang,7 Jason K. Kim,7 Franck Mauvais-Jarvis,8  Patricia Ducy,2 and Gerard Karsenty1,*

 

1Department of Genetics & Development 基因学与发展系

2Department of Pathology 病理学系

College of Physicians and Surgeons, Columbia University, New York, NY 10032, USA

美国纽约哥伦比亚大学内科医生和外科医生学院 邮编10032

3CHO-A Biotechnology Research Institute, CHO-A Pharm. Co., Seoul 143-701, Korea

韩国首尔CHO-A生物技术研究所,CHO-A制药公司 邮编:143-701

4 Ecole Normale Supe´ rieure de Lyon, UMR5161, Laboratoire d’Endocrinologie Mole´ culaire et Diffe´ renciation He´ matopoı¨e´ tique et Osseuse, 69364 Lyon, France

法国里昂高等师范学校,UMR5161,鼹鼠分子内分泌和造血细胞与骨骼分化实验室邮编:69364

5 Centre for Stem Cell Research, University of Cambridge, Cambridge CB2 1TN, United Kingdom

英国剑桥大学干细胞研究中心,邮编:CB2 1TN

6 Faculty of Dentistry, and Department of Anatomy and Cell Biology, McGill University, Montreal, QC, Canada H3A 2B2

加拿大蒙特利尔麦吉尔大学牙医学院解剖学和细胞生物学系,邮编:H3A 2B2

7 Department of Cellular & Molecular Physiology, Penn State Medical Center, Hershey, PA 17033

美国宾州州立大学医学中心细胞与分子生物学系,邮编:PA17033

8 Department of Medicine, Northwestern University School of Medicine, Chicago, IL 60611, USA

美国芝加哥西北大学医学院医学系,邮编:IL 60611

*Correspondence/联系邮箱:gk2172@columbia.edu

论文编号:DOI 10.1016/j.cell.2007.05.047

 

总论

通过脂源性激素调节骨质重塑意味着骨骼可能对能量平衡施加反馈控制。为了检验这一假设,我们寻找在造骨细胞中表达、编码信号分子和影响能量代谢的基因。我们发现,由于β细胞增生、胰岛素分泌和胰岛素敏感性的增加,缺乏蛋白酪氨酸磷酸酶OST-PTP的小鼠呈低血糖,免于肥胖和葡萄糖不耐受。相比之下,造骨细胞分泌的分子中缺乏骨钙素的小鼠呈β细胞增生、糖耐量和胰岛素抵抗力下降趋势。从缺乏OST-PTP的小鼠身上切下一个骨钙素等位基因就能纠正其代谢表型。在体外,骨钙素可以刺激β细胞以及脂肪细胞中的脂联素(增强胰岛素敏感性的脂肪因子)中的细胞周期蛋白D1和胰岛素表达;在体内,骨钙素可以改善糖耐量。这项研究通过揭示骨骼对糖稳态有内分泌调节作用,扩展了这一器官的生物学重要性,加强了我们对能量代谢的认识。

 

简述

在骨骼生物学领域的流行范式是两个骨特异性的细胞类型 —— 造骨细胞和破骨细胞之间的区别和其功能是由分泌的分子决定的,这些因子可能是起局部作用的细胞因子,或是起系统性作用的激素(Harada和 Rodan,2003;Teitelbaum和Ross,2003)。大多数激素调节的显著特征是:它们是由反馈回路控制,即受一种激素影响的细胞类型发送信号,影响生成激素的细胞。应用到骨骼生物学领域,反馈调节的概念表明骨细胞可能影响内分泌功能。

骨质重塑(即骨骼自我更新的过程)是由多种激素调节。肥胖使得哺乳动物免于骨质疏松症(这一现象)让我们提出骨质重塑和能量代谢可能由同类型激素调节的假设(Ducy等人,2000a)。在验证这一假设的过程中,我们发现瘦素(进化过程中瘦骨架上出现的一种脂源性激素)是调节骨质重塑的一种主要激素,它通过两个不同的神经通路作用于造骨细胞(Karsenty,2006)。尽管这种新型的神经内分泌调节具有分子复杂性特征,如果骨细胞确实决定生成激素的细胞的生物活性,则造骨细胞应该会影响能量代谢。

骨钙素(为数极少的造骨细胞特异性蛋白之一)具有激素的几种特性。比如,它是细胞特异性分子,作为prepromolecule(预分子)合成,并在总循环中分泌(Hauschka等人,1989;Price,1989)。由于其精妙的细胞特异性表达,(科学家们)已对骨钙素基因进行了深入的研究,以确定造骨细胞特异性转录因子,定义骨骼生理学的分子基础(Harada 和Rodan,2003)。在后面的研究过程中,我们生成了骨钙素-/-小鼠(Ducy等人,1996)。对这些基因突变小鼠进行分析时,我们发现其内脏脂肪量异常(PD和GK,未发表的数据)。这是骨骼可能会调节能量代谢的首个证据。

 

骨钙素经历不寻常的翻译后修正过程,谷氨酸残羧基形成γ-羧基谷氨酸(Gla)残基 —— 因此,它的另一个名称是骨Gla蛋白(Hauschka等人,1989)。Gla残基通常为矿物离子赋予高亲和力蛋白质,然而,损耗和增益功能实验未能证明骨钙素具有在体内细胞外基质矿化的功能(Ducy等人,1996;Murshed等人,2004 )。因此,目前骨钙素G-羧基化的生物学作用仍然不明(如果存在的话)。

 

造骨细胞的一个特征是其缺乏细胞特异性基因表达。我们利用这一属性,并且,为了证实富含造骨细胞的基因可能影响能量代谢,我们生成了不含编码信号分子,仅用(或最好用)造骨细胞表达的小鼠基因突变株。我们运用典型方法以及造骨细胞特定的方法,灭活了Esp(也称为Ptprv),一种以造骨细胞和支持细胞(Sertoli细胞)表达,对被称为OST-PTP的受体蛋白酪氨酸磷酸酶编码的基因(Mauro等人,1994)。值得注意的是,造骨细胞中缺少Esp的小鼠只显示β细胞增生、胰岛素分泌和胰岛素敏感性增加,使其免受诱发性肥胖和糖尿病;所有这些表型都是通过删除骨钙素的一个等位基因进行修正的。因此,骨钙素/的小鼠患上葡萄糖不耐症和肥胖症;基因和基于细胞的检测表明骨钙素有利于增加β细胞和脂肪细胞中的胰腺β细胞、胰岛素和脂联素表达。据我们所知,这项研究首次提供了生物体内证据,表明骨骼具有影响能量代谢的内分泌调节作用,从而可能会影响代谢紊乱的发生和其严重程度。

 

研究结果

Esp-/-小鼠模型的生成和围产期致死

我们利用一个LacZ等位基因敲到Esp位点,并进行原位杂交和实时PCR研究,进一步确认Esp表达限于骨骼和睾丸中。所有的分析证实Esp以造骨细胞表达,但不以胰腺β细胞或脂肪细胞表达(图1A、图1B和S5A)

我们运用LoxP / Cre重组酶技术,通过删除编码磷酸域的外显子,用典型方法(Esp-nLacZ;Dacquin等人,2004 )和造骨细胞特定的方法(Esposb-/-)扰乱Esp。将含有Esp骨髓等位基因的小鼠与a1(1)胶原酶Cre小鼠杂交(Dacquin等人,2002),生成造骨细胞特异性、缺乏Esp的小鼠(Esposb-/-;图 S1B) 造骨细胞中Esp位点的重组发生率高。因此,Esposb-/-造骨细胞中的Esp表达减少近90%,睾丸中的不受影响(图1C和1D)。为了清楚起见,在本文后面部分,我们对Esp-nLacZ 和 Esposb-/-小鼠的研究都用Esp-/-小鼠表述。

我们在幼鼠断奶期进行分析,发现Esp+/-小鼠杂交产下的Esp-/-幼鼠存活率从未超过20%,虽然它们外表看上去正常(图1E、S1C、S1D)。新生幼鼠野生型(WT)和Esp-/-幼鼠的骨骼标本制作分析未能检测到可以解释围产期致死的任何骨骼发育异常情况(图S1E与S1F)。因此,我们提出如下问题:Esp-/-幼鼠死亡是否是由于体液异常导致。如果是那样的话,纯合突变母鼠产下的突变幼鼠应该比杂合母鼠产下的幼鼠死亡率更高。虽然ESP+/-母鼠产下的Esp-/-幼鼠的死亡率从未达到15%,ESP-/-母鼠产下的Esp-/-幼鼠中35%在断奶期前死亡,表明Esp-/-幼鼠的死亡至少部分原因是体液异常导致。

 

Esp-/-小鼠的β细胞增生和胰岛素分泌增加

无论其遗传背景、性别、和删除类型如何,Esp-/-幼鼠身上观察到的唯一存在的体液异常情况是其出生时(吃奶前)血糖值降低3倍(图1G)。在一些突变幼鼠身上,其血糖值低到无法检测的程度。进食之后,成年Esp-/-小鼠的血糖值仍然低得反常(图1G)。新生和成年Esp-/-小鼠身上存在明显的高胰岛素血症,可以解释这种低血糖症(图1H)。同时,Esp-/-小鼠的血清C肽也有升高(图S2A),而Esp-/-小鼠的胰腺含量和血清胰高血糖素(胰岛α细胞为应对低血糖而分泌的一种激素)则处于正常值(图S2B)。Esp-/-小鼠出现严重的高胰岛素血症,这种特征能抑制胰高血糖素的分泌(Maruyama等人,1984;Raju和Cryer,2005),并且,很有可能拮抗本来会因低血糖症而引发的胰高血糖素分泌增加。野生型(WT)和Esp-/-小鼠的血清IGF-1和PYY值相似。令人惊讶的是,突变小鼠身上的血清胰淀素(一种由β细胞合成的蛋白质)减少了25%(图S2C-S2E)。

Esp-/-小鼠身上存在胰岛素分泌增加的情况是通过腹腔内(IP)的葡萄糖刺激胰岛素分泌实验证明(GSIS,图1I)。为了评估这种胰岛素分泌增加的情况对小鼠处理葡萄糖负荷的能力有何影响,我们在小鼠禁食一夜、腹腔注射葡萄糖(按体重的2克/公斤注射)后进行了葡萄糖耐受性实验(GTT)。这些实验表明Esp-/-小鼠的葡萄糖耐受程度明显高于野生型(WT)小鼠(图1J)。组织学和免疫组化结果分析显示胰腺的胰岛素含量、胰岛数量、胰岛大小、Esp-/-胰腺中的β细胞质量增加(图1K和1L)。而TUNEL检测未能发现任何不正常的细胞凋亡,Ki67免疫组化显示5天(P5)和1个月大的Esp-/-小鼠身上β细胞增殖增加了60%-300%(数据未显示,图1M)。

拍打拉筋抗糖尿病机理研究简报/王锡宁图1:Esp-/-小鼠的胰岛素分泌增加、β细胞增殖增加

(A) 新生Esp-/-幼鼠的LacZ染色组织显示骨骼和睾丸中存在ESP位点活动,但胰腺或脂肪垫中不存在ESP位点活动。

(B) 在1月龄幼鼠身上进行实时PCR检测,发现造骨细胞、脂肪细胞和胰岛中存在Esp表达。

(C) Southern blot分析显示Esposb-/-小鼠造骨细胞中的ESP位点存在高效重组。

(D) 采用实时PCR检测发现Esposb-/-小鼠造骨细胞中的ESP表达下降了90%,而睾丸中的ESP表达未变。

(E) Esp+/-小鼠杂交产下的Esp-/-幼鼠在断奶期显示百分比下降趋势。

(F) Esp+/-母鼠和Esp-/-母鼠产下的Esp-/-幼鼠在出生时和断奶期的存活率更低。

(G和H)野生型(WT)和Esp-/-幼鼠在进食前(PO)或图中显示的年龄段随机进食后的血糖值(G)和血清胰岛素值(H)。

(I-J)1月龄野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠的GSIS(I)和GTT(J)实验结果。

(K)H&E染色、胰岛素免疫染色和胰岛素/Ki67双重免疫染色实验显示野生型(WT)小鼠和1月龄Esp-/-幼鼠的胰岛更大,胰岛β细胞增殖增加。箭头处是胰岛,箭头指向Ki67阳性细胞。比例是100毫米(上面几排除外 —— 其比例是800毫米)。对1月龄野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠的胰岛数量、大小、β细胞质量进行骨组织形态计量学比较的结果(最后一排)。

(L)1月龄野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠的胰腺胰岛素含量。

(M)5天大(P5)、1月龄野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠胰岛中Ki67免疫反应性细胞数量的量化结果。除(I)和(J)之外的所有排中,对比野生型(WT)小鼠,其结果是°p < 0.05 和 *p < 0.01(学生实验)。在(I)和(J)排中,对比野生型(WT)小鼠,°p < 0.05,*p % ≤0.001(变异数分析之后进行了事后分析)。

 

Esp-/-小鼠的胰岛素敏感性增加

为了确定Esp-/-小鼠处理葡萄糖负荷的能力增强是否与胰岛素敏感性增加有关,我们进行了胰岛素耐量实验(ITT)。Esp-/-小鼠虽然有高胰岛素血症,对比野生型(WT)小鼠,其胰岛素敏感性明显增加(图2A)。高胰岛素正葡萄糖钳夹术分析证实了存在胰岛素敏感性增加的现象,通过与野生型同窝幼鼠对比,显示Esp-/-幼鼠的稳态葡萄糖输注率增加了50%以上(图2B)。这是由肌肉、棕色和白色脂肪、肝脏中胰岛素刺激的葡萄糖摄取量增加而导致的(表S1)。

拍打拉筋抗糖尿病机理研究简报/王锡宁图2:Esp-/-小鼠胰岛素敏感性和脂联素表达增加

除非另有说明,所有实验对比的是1月龄野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠。

(A)ITT。

(B)高胰岛素正葡萄糖钳夹术分析显示的葡萄糖输注率。

(C)通过实时PCR测得的骨骼肌中胰岛素敏感性指标。

(D)腓肠肌的电子显微镜图像(上排,20,000×)和线粒体面积的相应量(下排)。比例尺是1毫米。

(E)油红O染色的肝切片显示脂滴数目减少(上排),以及通过对Esposb-/-小鼠进行实时PCR监测(下排)得出的胰岛素靶基因表达修改情况。比例尺是50毫米。

(F)脂肪垫质量(脂肪垫重量超过体重)。

(G)能量消耗。

(H)禁食一夜后的血清甘油三酯水平。

(I)野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠的脂肪组织H&E染色情况(上排),以及每张幻灯片中100个测得的脂肪细胞中的各自粒径分布情况(下排)。比例尺是50毫米。

(J)脂肪生成、脂肪合成、脂肪吸收和脂肪分解的指标。

(K)进食和隔夜禁食小鼠的血清游离脂肪酸(FFA)含量。

(L)脂肪中的瘦素、抵抗素和脂联素含量。

(M)新生幼鼠喂奶前(P0)和图中显示的年龄段随机进食后的血清脂联素水平。

(N)野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠的脂联素靶基因表达。

在(A)图中,对比野生型(WT)小鼠,其结果是°P <0.05,* p≤0.001(变异数分析之后进行了事后分析);在(B)- (N)图中,对比野生型(WT)小鼠,其结果是* P<0.01(学生实验)。

 

我们还对骨骼肌和肝脏进行了分子和形态学分析。分析发现:相比野生型(WT)小鼠,Esp-/-小鼠肌肉中的Pgc1a表达(一种胰岛素靶基因),以及NrF1和Mcad(Pgc1a的两个靶基因)明显增加。这些结果表明在缺乏Esp的情况下,粒体活性增强。与这种假设相符的情况是:相比野生型(WT)小鼠,Esp-/-小鼠肌肉中的粒体面积较大,而肌肉质量和体重比则正常(图2D和S2F)。肝脏的Foxa2表达增加,而Pepck表达降低;Esp-/-小鼠肝脏中的脂肪含量也降低,这一特征与胰岛素敏感性增加吻合(图2E)。在所有的分析中,ESP+/-小鼠的表现与野生型同窝幼鼠类似(数据未显示)。

成年Esp-/-小鼠显示另一种表型:尽管有高胰岛素血症,其性腺脂肪垫明显比野生型同窝小鼠轻(图2F)。这种脂肪量减少仅限于内脏脂肪(图S2G)。可以解释这种表型的是:Esp-/-小鼠的能量消耗增加,

而食物的摄入量并没有受到影响(图2G和S2H)。相比野生型(WT)小鼠,Esp-/-小鼠的血清甘油三酯水平也较低(图2H)。虽然相比野生型(WT)小鼠,Esp-/-小鼠的脂肪细胞更少(野生型小鼠:93.2 ± 10.7 ×103脂肪细胞/脂肪垫[n= 5];Esp-/-小鼠:37 ± 5.1 3×103脂肪细胞/脂肪垫[n= 3]),但其体积更大(图2I)。为了理解这一表型,我们研究了多个分子指标的表达情况。C/EBPa、Srebp1c、脂肪酸合成酶(FAS)、脂蛋白脂酶(LPL)在野生型(WT)小鼠和Esp-/-小鼠脂肪细胞中的表达类似,这表明脂肪生成、脂肪合成和脂肪摄取并没有受到突变的影响(图2J)。相比之下,Esp-/-小鼠脂肪细胞中的周脂素和甘油三酯脂酶(Tgl)表达明显下降(其表达受胰岛素抑制的两种脂解基因)(图2J),表明Esp-/-小鼠的脂肪分解被抑制。因此,相比野生型同窝幼鼠,隔夜禁食后,Esp-/-小鼠的血清游离脂肪酸水平没有增加(图2K)。Esp-/-小鼠肿瘤坏死因子没有脂肪炎症,IL-6表达和血清值低(图S2I和 S2J)。

 

Esp-/-小鼠脂联素表达增加

为了揭示导致Esp-/-小鼠胰岛素敏感性增加的机制,我们研究了各种脂肪因子。抵抗素(一种调节胰岛素抵抗的脂肪素)的表达和血清值几乎不受ESP删除的影响;瘦素(一种胰岛素增敏激素)的情况也是如此(Friedman和Halaas,1998;Steppan等人,2001;图 2L 和 S2K)。另一方面,Esp-/-小鼠脂联素(一种增强胰岛素敏感性的脂肪因子)的表达及血清值分别增加了3倍和2倍(图2L和2M)。因此,Esp-/-小鼠的脂联素靶基因Acyl-CoA Oxidase、Ppara和Ucp2的表达增加(图2N;Kadowaki和Yamauchi, 2005)。

综上所述,灭活ESP,则胰腺β细胞增殖、胰岛素分泌和胰岛素敏感性增强,从而导致低血糖、减少肥胖几率。Esp-nLacZ-/-和Esposb-/-小鼠都能观察到这些异常情况表明造骨细胞可调节血糖动态平衡。

 

Esp-/-小鼠不会出现肥胖和葡萄糖不耐受情况

Esp-/-小鼠胰岛素分泌和胰岛素敏感性增加意味着这些突变小鼠可能不会出现肥胖和糖尿病。因为Esp-nLacZ-/-和Esposb-/-小鼠均出现同样的代谢和分子异常,我们只在Esp-nLacZ-/-小鼠身上检测了这一假设。我们使用了三种不同的检测方法。

首先,我们在1月龄幼鼠身上注射了金硫葡萄糖(GTG),使其下丘脑腹内侧产生病变(Brecher等人,1965)。在野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠身上,GTG均诱发下丘脑腹内侧病变(图S3)和贪食(图3A)。注射GTG三个月后进行分析,我们发现野生型(WT)幼鼠出现肥胖、葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗症状,并且,其血清甘油三酯水平也明显增加(图3B-3F)。相比之下,Esp-/-幼鼠保持着瘦体型、其脂肪垫质量和血清甘油三酯水平与经PBS处理的野生型(WT)幼鼠数值相似,并且,没有出现葡萄糖不耐受或对胰岛素不敏感的情况(图3B-3F)。

第二、我们对野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠喂食了高脂肪食物(HFD)6周。如图3G-3I所示,相比野生型(WT)幼鼠,喂食了高脂肪食物(HFD)的Esp-/-幼鼠增重少很多,并且没有像野生型(WT)幼鼠那样出现葡萄糖不耐受或胰岛素抵抗现象。

第三、我们想要知道胰岛素敏感性增加是否能够保护Esp-/-小鼠免于出现胰腺β细胞功能衰竭。为此,我们给小鼠注射了链脲佐菌素(STZ),以便触发β细胞的氧化应激和细胞死亡(May等人,2006)。STZ明显降低两个基因型中胰腺的胰岛素含量和血清胰岛素水平(图3J和3K)。STZ注射后八天,7个野生型(WT)幼鼠死了3个,并且所有幸存的幼鼠血清胰岛素水平均高于500毫克/分升(图3L和3M)。相比之下,在此期间,仅有一只Esp-/-小鼠死亡,幸存的小鼠血清胰岛素水平没有超过250毫克/分升。与经STZ处理的野生型(WT)幼鼠不同的是,注射STZ的Esp-/-幼鼠尿液中检测不到葡萄糖(图3N)。由于经STZ处理的野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠出现类似的胰岛素含量减少现象,经STZ处理的Esp-/-幼鼠身上缺少明显的糖尿病表型表明其胰岛素敏感性增加保护它们免于患上糖尿病。

这三项实验的结果表明小鼠出现肥胖和葡萄糖不耐症需要Esp功能。

 

Esp影响造骨细胞分泌的分子的生物活性

为了进一步证实Esp是通过其在造骨细胞中的表达来调节葡萄糖代谢的,我们接下来进行了增益功能实验。转基因小鼠造骨细胞中选择性地过度表达全长ESP cDNA(a1(I)-Esp小鼠),表明在进食状态下,β细胞增殖减少、β细胞质量降低、胰岛素含量降低;并且,表现为与葡萄糖相应的胰岛素分泌受损(图4A-4C)。它们还显示出较低的血清脂联素浓度(图4B)。因此,a1(I)-Esp小鼠通常出现高血糖、葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗现象(图4B、4D、4E)。在小鼠造骨细胞中观察到ESP过度表达,可支持如下观点:OST-PTP调节造骨细胞派生、分泌的分子的生物活性,调节葡萄糖稳态。只在转基因小鼠身上观察到过度表达全长Esp,表明OST-PTP的磷酸酶活性参与影响葡萄糖动态平衡。

拍打拉筋抗糖尿病机理研究简报/王锡宁图3:Esp-/-小鼠不会出现肥胖和葡萄糖不耐受现象

(A-F)4月龄野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠在注射GTG或纯注射液(vehicle injection,即注射液中不含GTG等成分)3个月后的每日食物摄入量(A)、体重曲线(B)、脂肪垫质量(C)、血清甘油三酯水平(D)、GTT(E),以及ITT(F)。

(G-I)3月龄野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠在喂食高脂肪食物6周的体重曲线(G)、GTT(H)和ITT(I)。

(J和K)1月龄野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠在注射STZ或纯注射液(vehicle injection,即注射液中不含GTG等成分) 8天后的血清胰岛素水平(J)和胰腺中的胰岛素含量(K)。

(L和M)1月龄野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠在注射STZ后8天中的存活率(L)和血糖值变化情况(M)。

(N)1月龄野生型(WT)幼鼠和Esp-/-幼鼠在注射STZ后8天后的尿糖检测结果。

(A)-(F)、(J)、(K):A:WT小鼠对照 Esp-/-小鼠;B:WT小鼠注射GTG(或STZ)对照 WT小鼠注射纯注射液;C:WT小鼠注射GTG(或STZ)对照 Esp-/-小鼠注射GTG(或STZ);D:Esp-/-小鼠注射GTG (或STZ)对照 Esp-/-小鼠注射纯注射液。在图(G)–(I)和(M)中,*p < 0.05 WT小鼠对照 Esp-/-小鼠。在图(A), (C), (D), (J)和(K)中(学生实验),a–d 为p < 0.05; 在图(B) (E)–(I), (L)和(M), 变异数分析之后进行了事后分析,组数> 2,a–d 为p ≤ 0.001。

 

接下来,我们共培养了造骨细胞,这是附着在胰岛细胞或脂肪细胞(它们不是粘附细胞)上的粘附细胞。将野生型(WT)小鼠各类造骨细胞与从野生型(WT)小鼠分离出的胰岛细胞共培养增加胰岛素表达40%(图4F)。造骨细胞对胰岛素表达的增强是特异性的,因为成纤维细胞没有这种功能。与Esp-/-小鼠身上观察到的胰岛素分泌增加相应的是,相比野生型(WT)小鼠的造骨细胞,Esp-/-小鼠造骨细胞能更大程度上增加胰岛素表达(图4F)。胰高血糖素(胰岛细胞中以另一种细胞类型表达的基因)的表达则不受造骨细胞影响(图4F),这进一步表明胰高血糖素表达不受Esp失活影响。我们还共培养了脂肪细胞和造骨细胞或成纤维细胞。野生型(WT)小鼠的造骨细胞(而非成纤维细胞)增加了脂联素的表达,并且,Esp-/-小鼠造骨细胞的效力大两倍;脂联素是实验过的脂肪因子中其表达受影响的唯一一个(图4G)。将野生型(WT)小鼠造骨细胞于与Esp-/-小鼠胰岛细胞或脂肪细胞共培养的对照实验表明:与使用野生型(WT)小鼠胰岛细胞或脂肪细胞相比,胰岛素和脂联素表达显示出同样的增幅(图4H)。造骨细胞中瘦素和脂联素表达的研究,以及脂肪细胞中造骨细胞指标的研究,在本实验结束时没有检测到这些基因存在错误表达,因此排除转分化事件(图S4A-S4D)

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图4:造骨细胞分泌一种因子,调节胰岛素和脂联素表达

(A-E)所有的实验比较的是1月龄野生型(WT)幼鼠和a1(I)-Esp小鼠。(A)对胰岛数量、大小、β细胞质量和胰腺中的Ki67免疫反应细胞(下排)的胰岛素免疫染色(上排)及组织形态学比较结果。比例尺是100毫米。(B)血糖及血清胰岛素/脂联素水平。(C)GSIS测试。(D)GTT。(E)ITT。

(F)野生型(WT)小鼠胰岛细胞与成纤维细胞或造骨细胞共培养的胰岛素和胰高血糖素表达。

(G)野生型(WT)小鼠脂肪细胞与成纤维细胞或造骨细胞共培养的脂联素和瘦素表达。

(H)Esp-/-小鼠标示细胞与成纤维细胞或造骨细胞共培养的胰岛素和脂联素表达。

(I和J)使用防止细胞与细胞接触的过滤器,或者使用从造骨细胞培养物收集的条件培养液(CM)情况下;野生型(WT)小鼠标示细胞与/不与造骨细胞共培养的胰岛素(I)和脂联素(J)表达。图(A、B和F-J)中,* P <0.05对照野生型(WT)小鼠(学生

t实验)图(C-E)中,°P <0.05对照野生型(WT)小鼠;* p≤的0.001对照野生型(WT)小鼠(ANOVA)。

 

为了确定造骨细胞是通过释放分泌的分子调节胰岛素和脂联素表达,我们首先使用防止细胞与细胞接触的过滤器共培养了造骨细胞和胰岛细胞或脂肪细胞。接下来,我们在造骨细胞培养物上清液中培养了胰岛细胞和脂肪细胞。在这两种情况下,我们均观察到胰岛素和脂联素表达显著增加(图4I及4J)。

 

造骨细胞分泌的因子骨钙素有利于β细胞增殖、胰岛素分泌和胰岛素敏感性

在搜索Esp控制下调节葡萄糖稳态的造骨细胞特异性分泌分子时,我们将注意力集中在缺乏骨钙素的小鼠(Ocn-/-小鼠)身上,因为我们注意到其出生时异常肥胖。

相比野生型(WT)小鼠,Ocn-/-小鼠的血糖值更高,血清胰岛素值更低(图5A和5B)。根据GSIS、GTT、ITT和高胰岛素正葡萄糖钳夹术分析,Ocn-/-小鼠的胰岛素分泌、胰岛素敏感性、葡萄糖耐受性以及能量消耗都有下降(图5C-5G;表S1)。骨骼肌和肝脏中的胰岛素靶基因表达下降,而Pepck表达增加(图5H)。Ocn-/-小鼠的胰岛细胞大小、数量、β细胞质量、胰腺胰岛素含量和胰岛素免疫反应均显著下降(图5I)。Ki67 免疫染色检测出Ocn-/-小鼠胰腺中的β细胞增殖下降了2倍(图5I)。同时,Ocn-/-小鼠的脂肪量和脂肪细胞数量增加(野生型(WT)小鼠:93.2 ± 10.7 3 103 脂肪细胞/脂肪垫[n =5];Ocn-/-小鼠:125.6 ± 10.6 3 103脂肪细胞/脂肪垫[n =3]),血清甘油三酯水平(图5J,5K)。Ocn-/-小鼠的脂联素表达和血清水平明显低于野生型(WT)小鼠,而其他脂肪细胞因子的表达不受影响(图5L和图5M)。在Ocn-/-小鼠身上,脂联素作用的分子靶标表达下降(图5N)。OCN+/-小鼠与野生型同窝小鼠之间的差异几乎难以察觉(图7A-7G)。这些异常现象都是在正常进食的小鼠身上观察到的。我们证实胰岛细胞或脂肪细胞中不存在骨钙素表达(图S5A及S5B)。

共培养实验结果表明:Ocn-/-小鼠造骨细胞不能增强胰岛素和脂联素表达(图5O和5P)。不表达骨钙素的野生型(WT)小鼠未成熟的造骨细胞(Ducy等人,2000b)不能诱发胰岛素和脂联素表达(图5R)。与此相反,COS细胞中强迫表达骨钙素可以使这些细胞增强胰岛素和脂联素表达(图5Q)。我们还在野生型(WT)小鼠成纤维细胞和β细胞共培养物中添加了细菌产生的重组骨钙素(3 ng/ml,图S6C),并观察到其诱发胰岛素表达,这一现象不能由成纤维细胞触发(5R图)。

为了进一步证实这些以细胞为基础的实验研究结果,我们检测了重组骨钙素能否影响葡萄糖在体内的代谢。为此,我们对Ocn-/-小鼠进行了GTT实验,其中50%的小鼠只注射了葡萄糖,而其余50%的小鼠注射了葡萄糖和重组骨钙素(20 ng)。这项实验的30、60和120分钟时间点上,骨钙素显著降低血糖水平(图5S)。同时,GSIS实验显示骨钙素增加了胰岛素分泌(图5T)。这些实验结果与骨钙素是由造骨细胞分泌的一种分子,能够增加胰岛素和脂联素表达的概念相吻合。

 

骨钙素通过脂联素调节胰岛素敏感性

要确定胰岛素和脂联素是否都对Ocn-/-小鼠的代谢表型有影响,我们问了两个相关问题:骨钙素调节脂联素与其对胰岛素分泌的影响无关吗?如果是这样的话,Ocn-/-小鼠身上观察到的脂联素表达减少能否解释其胰岛素敏感性下降?为了解决这些问题,我们生成了复合杂合子Ocn+/-小鼠和脂联素(Adipo)+/-小鼠。这些小鼠的胰岛素敏感性显著下降,而根据GSIS分析,其血糖值、血清胰岛素水平和胰岛素分泌仍维持在正常范围(图6A-6D)。相比野生型(WT)小鼠或单杂合子小鼠,Ocn+/-小鼠和脂联素(Adipo)+/-小鼠的血清脂联素水平也显著下降(图6E)。这些观测结果与这一假设相吻合:骨钙素调节胰岛素敏感性与其对胰岛素分泌的影响无关,并且,此种胰岛素敏感性调节的发生至少部分受到脂联素的影响。

 

OST-PTP调节骨钙素的生物活性

Ocn-/-小鼠的代谢表型可以反映出Esp-/-小鼠身上观察到的结果,表明后者身上存在骨钙素活性增强的现象。如果是这样,那么Esp-/-小鼠的代谢异常应该可以通过减少骨钙素表达加以修正。事实上,缺少一个骨钙素等位基因的Esp-/-小鼠的所有代谢异常明显逆转(图7A-7F)。此外,Ki67染色实验表明这些突变小鼠的β细胞增殖也有所降低(图7G)。Esp-/-小鼠的骨钙素表达和血清水平正常,因此,排除了OST-PTP调节骨钙素表达的可能性(图S6A和S6B)。这些结果为Esp和骨钙素调节路径相同提供了遗传学(基因)证据,并且推断出Esp-/-小鼠的代谢表型是由这种激素的活性增强导致。

野生型(WT)小鼠和Esp-/-小鼠的r-羧化水平(骨钙素翻译后修正的主要指标)有所不同吗?相比未羧酸化骨钙素,羧化骨钙素的羟基磷灰石(HA)具有较高亲和力(Hauschka等人,1989;Price等人,1989)。如图7H中所示,15分钟的潜伏期后,野生型(WT)小鼠血清中90%的骨钙素与HA绑定,而Esp-/-小鼠血清中只存在74%。这个实验表明:OST-PTP通过调节r-羧水平影响骨钙素功能,并且,是未羧酸化的骨钙素在调节葡萄糖稳态。为了测试后一种假设,我们进行了两个附加实验。首先,在共培养实验之前和期间,我们在野生型(WT)小鼠造骨细胞中注射了华法林(warfarin,一种r-羧抑制剂,Berkner,2005年)。这种处理导致与HA绑定的骨钙素百分比显著下降(图7J);并且,经华法林(warfarin)处理的造骨细胞诱发的脂联素表达明显高于注射纯注射液的造骨细胞诱发的脂联素表达(图7K)。其次,我们在基于细胞的检测中使用了羧基化的骨钙素和细菌产生的骨钙素(因此未羧酸化)(图S6C)。只有未羧酸化的骨钙素能够诱发脂肪细胞中的脂联素表达,以及胰岛细胞中的胰岛素和细胞周期蛋白D1(一种细胞增生的分子指标)表达(Kushner等人,2005;图7K及7L)。

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图5:骨钙调节β细胞增殖、胰岛素分泌和胰岛素敏感性

除非另有说明,所有实验对比的是3月龄的野生型(WT)小鼠和Ocn-/-小鼠。

(A) 随机进食后的血糖值。

(B) 胰岛素值。

(C) GSIS实验。

(D) GTT实验。

(E) ITT实验。

(F) 高胰岛素正葡萄糖钳夹术分析期间的葡萄糖输注率。

(G) 能量消耗。

(H) 实时PCR测得的胰岛素靶基因表达。

(I) 胰岛中的胰岛细胞数量、大小、β细胞质量、胰岛素含量,和胰岛细胞中Ki67免疫反应细胞的组织形态学比较结果。P5:5天大的幼鼠;3M:3月龄幼鼠。

(J) 脂肪垫质量(脂肪垫与体重比)。

(K) 禁食一夜后的血清甘油三酯水平。

(L和M)血清水平(L)和脂联素的基因表达(M)。

(N) 实时PCR测得的脂联素靶基因表达。

(O) 将野生型(WT)小鼠的胰岛细胞和标示基因型的造骨细胞共培养得出的胰岛素和胰高血糖素表达。

(P) 将野生型(WT)小鼠的脂肪细胞和标示基因型的造骨细胞共培养得出的脂联素和瘦素表达。

(Q) 在转染骨钙素表达矢量或其空的对应物的COS细胞的条件培养基中培养的野生型(WT)小鼠标示细胞的胰岛素和脂联素表达。

(R) 在存在重组骨钙素(0.3纳克/毫升)、注射纯注射液,或者表达(5天)/不表达(1天)骨钙素的造骨细胞条件下,将野生型(WT)小鼠胰岛细胞、脂肪细胞与成纤维细胞共培养的胰岛素和脂联素表达。

(S和T) 同时注射葡萄糖和20 ng重组骨钙素的Ocn-/-小鼠的动态葡萄糖(S)和胰岛素水平(T)。(图A、B和F-R)中,*p < 0.05对比野生型(WT)小鼠(学生t实验);(图C-E、S和T)中,°p≤0.01对比野生型(WT)小鼠;*p≤0.001对比野生型(WT)小鼠(ANOVA)。

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图6:骨钙素通过脂联素调节胰岛素敏感性

(A-E)6周龄野生型(WT)小鼠,脂联素+/-(Adipo+/-)、骨钙素+/-(Ocn+/-)和Ocn+/-、Adipo+/-小鼠的对比结果。(A)ITT。(B)血清胰岛素水平。(C)血糖值。(D)GSIS实验结果。(E)血清脂联素水平。在图(A)和(D)中,*p ≤ 0.001对照野生型(WT)小鼠(ANOVA之后进行事后分析);在图(B)、(C)和(E)中,*p < 0.05对照野生型(WT)小鼠(学生t实验)。

 

讨论

这项研究的结果揭示了造骨细胞中存在的新路径,导致其分泌出一种可改善葡萄糖稳态的激素。我们的研究结果扩展了骨骼的功能范围,进一步证实了骨骼和能量代谢之间相互调节的理念(Ducy等人,2000a),并且,还表明一些能量代谢的退行性疾病的发病机理可能比预期的更为复杂。

 

小鼠基因揭示器官之间的新串扰

小鼠基因调控一直是一个强大的工具,可以帮助我们更好地认识脊椎动物的生理。例如,一直以来反复证实的情况是未发现器官执行任何调节影响,实际上,器官在履行着重要的内分泌功能。比如,通过分泌脂联素影响脂肪、通过胆汁酸影响肝脏、通过合成Emilin(调节血压的一种物质)影响血管平滑肌细胞(Spiegelman和Flier,2001;Watanabe等人,2006;Zacchignaet等人,2006)。这种基因研究方法对整个动物生理学有不可预见的影响。例如,将先前认为不会相互影响的器官联系起来,并且表明我们并不知道大多数主要器官的全部功能。对于骨骼就是如此。

 

造骨细胞调节β细胞和脂肪细胞的生理状况

脂肪细胞通过作用于造骨细胞调节骨量,表明造骨细胞可能影响脂肪细胞的生理状况(Ducy等人,2000年)。这里的一些观察报告表明:事实上,造骨细胞分泌出影响能量代谢的激素,虽然这在意料之外,然而,这是非常重要的。例如,删除造骨细胞中的Esp会导致β细胞增殖增加;鉴于目前强调刺激β细胞增殖,从治疗的角度来看,造骨细胞的这一功能具有重大的潜在价值。野生型(WT)小鼠,尤其是Esp-/-小鼠造骨细胞能在短时间内增强隔离的胰岛细胞的胰岛素表达,这表明这一功能与其促进细胞增殖的能力无关。奇怪的是,虽然其对胰岛素分泌有此影响,野生型(WT)小鼠,尤其是Esp-/-小鼠造骨细胞能增强脂肪细胞中的脂联素表达(其过度表达会增强胰岛素敏感性的一种脂肪细胞因子,Otabe等人,2007)。这进一步解释Esp-/-小鼠身上的胰岛素敏感性为何增加。因此,本文描述的造骨细胞的所有代谢功能都有可能增强体内葡萄糖处理的能力。曾有科学家提出人体中的Esp是一种假基因(Cousin等人,2004)。然而,人体造骨细胞中存在两种相近的Esp同系物的表达,这表明他们可能履行这一功能(数据未出示)。

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图7:Esp-/-小鼠是一种加强骨钙素生物活性的模型

(图A-G)6周龄野生型(WT)小鼠,Esp-/、Ocn+/-和Esp-/-、Ocn+/-小鼠的对比结果。(A)血糖值。(B)血清胰岛素水平。(C)血清脂联素水平。(D)GSIS实验结果。(E)ITT实验结果。(F)GSIS实验结果。(G)胰岛细胞中的Ki67免疫反应细胞数量。

(H和I)标示基因型1月龄小鼠(H),或用华法林(warfarin)或纯注射液处理的造骨细胞培养液的条件媒介(I)中血清孵育15分钟后,与羟基磷灰石(HA)树脂结合的骨钙素的百分比。

(J)野生型(WT)小鼠脂肪细胞与用华法林(warfarin)或纯注射液处理的造骨细胞共培养的脂联素表达。

(K)在纯注射液、或1纳克/毫升市售羧化骨钙素(Immunotopics),或细菌生成的未羧酸化骨钙素中培养的野生型(WT)小鼠脂肪细胞的脂联素表达。

(L)0.3纳克/毫升细菌生成的未羧酸化骨钙素或纯注射液中培养的野生型(WT)小鼠胰岛细胞的胰岛素和细胞周期蛋白D1表达。在图(A)–(C)和图(G)–(L)中:*p < 0.05对照野生型(WT)小鼠(学生t实验);在图(D)–(F)中,°p < 0.05对照野生型(WT)小鼠,*p ≤0.001对照野生型(WT)小鼠(ANOVA之后进行事后分析)。

调节造骨细胞的代谢功能

造骨细胞的代谢功能的基因和分子基础是什么?使用过滤器分开每种细胞类型的共培养实验表明,是通过释放一个或多个激素实现造骨细胞代谢功能调节的。缺乏造骨细胞特异性分泌的分子骨钙素的小鼠会出现一系列的表型异常,比如,胰岛素分泌减少、β细胞增殖减少、胰岛素抵抗减少;肥胖、血清甘油三酯水平增加,这与在Esp-/-小鼠身上观察到的情况相符。删除一个等位基因的骨钙素可纠正ESP-/-小鼠的代谢异常。在细胞培养液中,骨钙素刺激β细胞中的细胞周期蛋白D1表达,并复制造骨细胞对胰岛素和脂联素表达的影响。在骨钙素-/-小鼠身上再次引入纯化骨钙素可纠正其葡萄糖不耐症,使胰岛素分泌增加。将这些观察结果全盘分析表明,骨钙素是一种参与能量代谢调节,由骨骼分泌的激素。这并不排除如下可能性:造骨细胞可能分泌其他激素调节能量代谢。其他细胞类型,比如脂肪细胞,也分泌调节能量代谢的多种激素(Spiegelman和Flier,2001)。

这些证据表明未未羧酸化骨钙素在调节这种激素的代谢功能。OST-PTP影响这种翻译后的修正的机制仍然不明。值得强调的是:大多数循环激素与调节蛋白有关,并且处于非活跃状态。因此,只有10%的骨钙素具有生物活性,这与内分泌学的一般规则相符(DeGroot和Jameson,2001)。此外,当羧化残基被删除时,至少一个其它克-羧基化蛋白,凝血酶原变得具有生物活性(Furie和Furie,1988)。

 

骨架和能量代谢调节

我们的研究结果进一步证实了这一概念:骨骼和能量代谢相互进行互益的调节。事实上,Esp-/-小鼠能够抵抗肥胖、葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗,以及造骨细胞特异性骨钙素表达证实骨架作为一种变阻器调节葡萄糖代谢。这也提出一种可能性:骨架可能有助于形成代谢综合症,因为Esp-/-小鼠不会出现肥胖或糖尿病。临床观察显示2型糖尿病患者的血清骨钙素水平显著下降,而在改善血糖控制后变得正常,这与这一概念相符(Rosato等人,1998)。

最后,我们的研究结果提出了一些目的论问题:例如,为何骨骼特异性激素能够调节能量代谢?有利于β细胞增殖和胰岛素分泌的激素用来做什么?对于这两种情况,我们只能做出猜测。对于第一个问题,鉴于其覆盖面很广,骨架是合成激素的一个上佳场地。沿着这一思路,有可能造骨细胞中还存在其他激素有待识别。另外,在进化过程中,骨钙素和有可能其他激素可能通过修修补补“招募”到骨架中。至于第二个问题,可以想象的是,造骨细胞分泌的激素所具有的有利于增殖的功能可能在进化过程中是需要的,以便在食物匮乏时期使胰岛细胞数量维持不变。

 

实验程序

生成小鼠

Esp-nLacZ小鼠和Osteocalcin-/-小鼠的生成已有先例(Dacquin等人,2004;Ducy等人,1996)。为了生成造骨细胞特异性缺乏Esp((Esposb-/-)的小鼠,内含子23和35中含有LoxP位点的靶向载体,以及新霉素抗性盒被电穿孔进入ES细胞。靶向ES细胞被注入129Sv/EV胚囊,以生成含有变色等位基因(Espflox)的嵌合体小鼠。Espflox/+小鼠与a1(I) 胶原蛋白酶Cre小鼠杂交,生成Esposb-/+小鼠,其后代互交后生成Esposb-/-小鼠。根据先前描述的策略生成了脂联素+/-小鼠(Maeda等人,2002)。通过原核注入一个构建融合的全长Esp cDNA和小鼠类型I胶原蛋白启动子的造骨细胞特异性片段生成转基因a1(I)-Esp小鼠(Dacquin等人,2002)。涉及到动物的所有实验程序均由IACUC批准通过,并且符合相关监管标准。

 

代谢研究

在糖耐量实验(GTT)中,小鼠禁食一夜后腹腔注射(IP)了葡萄糖(体重的2 g/kg[BW]),使用血糖试纸和精确检测血糖仪(Roche罗氏)监控标示时间点的血糖值。在葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(GSIS)中,小鼠禁食一夜后腹腔注射(IP)了葡萄糖(体重的3 g/kg BW);从小鼠尾巴处收集了血清,根据描述的方法测量了胰岛素(Mauvais-Jarvis等人,2000)。在胰岛素耐量实验(ITT)实验中,小鼠禁食6小时后腹腔注射(IP)了胰岛素(0.2 U/kg BW),根据描述的方法,在标示时间点测量了血糖值(Mauvais-Jarvis等人,2002)。ITT数据是用最初的血液葡萄糖浓度的百分比表示的。在宾夕法尼亚州立大学小鼠代谢表型研究中心(Penn State Mouse Metabolic Phenotyping Center)进行的高胰岛素正葡萄糖钳夹术分析。简言之,Esp-/-小鼠、Ocn-/-小鼠和野生型同窝小鼠(每组n=~4–8)均禁食一夜,使用先前描述的方法,根据[3-3H]葡萄糖和2-脱氧-D-[1-14C]葡萄糖的静脉注射管理规定进行了2小时的高胰岛素(2.5 mU/kg/min)正葡萄糖钳夹术分析(Kim等人,2004)。腹腔注射了金硫葡萄糖注射(600 mg/kg BW,USP),3个月后杀死了小鼠进行分析。根据描述的方法进行了高脂肪食物(HFD)研究(Elefteriou等人,2006)。进食HFD之后,每3周测量了体重;在小鼠进食HFD6周之后进行了GTT和ITT实验。腹腔注射了链脲霉素(单次注射150 mg/kg),此后每2天以上根据描述的方法测量一次血糖。8天后,分离出胰腺以便根据先前描述的方法测量胰岛素含量(Mauvais-Jarvis等人,2000)。使用代谢笼作为每日食物重量变化测量食物摄取情况。使用与量热仪相连的代谢笼测量能量消耗。两天后记录热值(千卡/小时),并报告给每只老鼠的BW。

 

实验室测量

通过对进食和禁食状态下的异氟醚麻醉小鼠进行心脏穿刺收集血液。用比色测定法测定游离脂肪酸和甘油三酸酯的血清水平(Sigma)。用ELISA对血清胰岛素和瘦素(Crystal ChemInc.公司的套件);脂联素、抵抗素、Amylin和PYY(Linco套件);C-肽(Gentaur套件);IGF-1(DSL套件)进行了测量。用IRMA(Immunotopics套件)对人体和小鼠骨钙素水平进行测量。

 

小鼠胰岛和原代细胞的分离和培养

在HISTOPAQUE梯度上分离出胰岛细胞。简单地说,在其通向十二指肠的入口处夹紧胆总管后,向胆总管中注射M199培养基中的1 mg/ml collagenaseP。将肿大的胰腺手术切除后,在摄氏37度孵育17分钟。通过移液、漂洗两次以及光谱网(400 mm)过滤,分散出已消化的胰腺,再悬浮于HISTOPAQUE,并用M199培养基覆盖。通过在1,700 g时离心处理20分钟收集胰岛细胞,用冷的M199培养基漂洗两次,再悬浮于M199/ 1%NCS或aMEM/1%FBS培养基中,并在摄氏37度下在5%CO2中培养。

通过胶原酶消化从附睾脂肪垫中分离出原代脂肪细胞。简单地说,在KRP缓冲液(20 mM HEPES, 120 mM NaCl, 6 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 0.6 mM Na2HPO4, 0.4 mM NaH2PO4, 2.5 mM D-glucose, 2%BSA, pH 7.4)中注射1 mg/ml collagenaseP,以消化碎脂肪组织(摄氏37度下1小时)。在摄氏37度时在5%CO2中,在aMEM/1�S中培养之前,用KRP缓冲液将分离出的细胞洗涤两次。

根据先前描述的方法从5天龄幼鼠的颅骨中制备原代造骨细胞(Ducy等人,2000a),并在存在100 mg/ml抗坏血酸和5mMβ-甘油磷酸的情况下在aMEM/10% FBS中培养5天。通过胶原酶消化法(0.5 mg/ml)分离出皮肤成纤维细胞,并在aMEM/ 10% FBS中培养。在添加原代胰岛细胞(或脂肪细胞)之前24小时,将造骨细胞(或成纤维细胞)置入aMEM/1�S中。在aMEM/F12/10�S中维持原代造骨细胞的华法林(warfarin)处理,直到在与脂肪细胞共培养之前48小时,在aMEM/F12/1�S中补充注射50 mM华法林(warfarin)或纯注射液。存在/不存在(1 mm)培养插入(Falcon)条件下共培养4小时后,使用TRIZOL从RNA隔离中收集胰岛细胞(或脂肪细胞)。

 

基因表达分析

实时PCR实验在如下情景进行:在一个MX3000仪表上,用引物将DNaseI处理的总RNA转化为cDNA(从SuperArray和Taq SYBR Taq SYBR Green Supermix与ROX);β肌动蛋白扩增用作每个样品的内部参考;图7L除外,该图使用胰高血糖素表达作为参考。根据描述的方法进行了X-gal染色试验(Dacquin等人,2004)。

 

组织学研究

肝脏冷包埋,在5毫米处切片,用油红O染色。脂肪和胰腺组织切片在10%中性福尔马林中固定,用石蜡包埋,在5毫米处切片,切片用苏木精和曙红(H&E)染色。使用兔抗胰岛素(SANTACRUZ,1:100)、小鼠抗Ki67(矢量,1:100)抗体和ABC精英套件(矢量)进行免疫组化。为了评估细胞大小或数量,使用配备CCD摄象机(SONY)的Leica显微镜和Osteomeasure软件,用40×目标分析5-10个切片(间距50毫米)。β细胞面积表示胰岛素免疫染色除以胰岛总面积的表面阳性值。β细胞质量为β细胞面积乘以胰腺重量。每种条件至少分析了3只小鼠。胫骨前肌被固定在4%PFA/ 2%戊二醛/0.1钠二甲胂酸pH值7.3中,后固定在1%四氧化锇中,用环氧树脂(EPON)包埋。超薄切片在4%水溶液醋酸铀中染色,在雷诺兹柠檬酸铅中染色2分钟,然后,用JEOL 2000FX检测。对每只小鼠的10个电镜照片进行了数字化处理,使用ImageJ软件对每个清晰可见的线粒体的面积进行了分析。对每种基因型的四只小鼠测定了其15-25个单独线粒体。

 

骨钙素的生成和羟基磷灰石结合分析

根据标准程序,使用细菌生成GST-骨钙素融合蛋白,并在谷胱甘肽珠上纯化。然后,使用凝血酶从GST亚基中切出骨钙素,使用SDS-PAGE对其纯度进行了评估。将1月龄小鼠的血清,或华法林处理的造骨细胞培养液中的上清加入羟基磷灰石(HA)浆中,以达到25毫克浆/毫升的最终浓度。15分钟后,HA珠通过离心进行制粒处理,用0.5M磷酸钠缓冲液(pH 8.0)洗脱与HA结合的骨钙素。用IRMA测量洗脱液和初始样本中存在的骨钙素。所得值用HA结合的骨钙素除以初始骨钙素含量的百分比表示。

 

统计数据

实验结果用平均值±标准偏差表示,图2 B和5F除外(用平均值±标准误差表示)。使用不成对、双尾学生t实验,或ANOVA测试后进行事后测试进行了统计分析。

 

补充数据

可在下列链接中找到本文和补充数据(包括6种数据和一个表格): http://www.cell.com/cgi/content/full/130/3/ 456/DC1/

 

鸣谢

感谢X. Liu、S. Houlihan、L. Malynowsky和R. Wilson向我们提供帮助;感谢Drs. D. Accili、 T. Kitamura和R. Leibel提出意见和建议;感谢Dr. R. Axel批判性地阅读论文稿。M.D.M.是魁北克健康研究基金会的一名学者。这项研究工作的资金来源:日本学术振兴会(JSPS)(E.H.)提供的奖学金,以及美国国立卫生研究院(NIH)(G.K.)、美国糖尿病协会(the American Diabetes Association)和宾夕法尼亚卫生署(the Pennsylvania Department of health)(J.K.)提供的赠款。

 

收稿日期:2006年12月9日

修订日期:2007年3月17日

接受日期:2007年5月21日

发表日期:2007年8月9日

 

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Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30

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Loss of the decrement in intraislet insulin plausibly explains loss of the glucagon response to hypoglycemia in insulin-deficient diabetes: documentation of the intraislet insulin hypothesis in humans.

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《胆汁酸通过促进细胞内甲状腺激素的激活诱发能量消耗》

发表在《自然》(Nature)杂志第439期,第484–489页。

 

原文:Yamauchi, T., Kamon, J., Waki, H., Terauchi, Y., Kubota, N., Hara, K., Mori, Y., Ide, T., Murakami, K., Tsuboyama-Kasaoka, N., et al. (2001). The fat-derived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity. Nat. Med. 7, 941–946.

译文:

Yamauchi T.,Kamon J.,Waki H.,Terauchi Y.,Kubota N.,Hara K.,Mori Y.,Ide T.,Murakami K.,Tsuboyama-Kasaoka N.等人(2001)。The fat-derived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity

《脂肪源性脂联素反转与脂肪萎缩和肥胖相关的胰岛素抵抗》

发表在《自然医学》(Nature Medicine)第7期,第941–946页。

 

原文:Zacchigna, L., Vecchione, C., Notte, A., Cordenonsi, M., Dupont, S., Maretto, S., Cifelli, G., Ferrari, A., Maffei, A., Fabbro, C., et al. (2006). Emilin1 links TGF-beta maturation to blood pressure homeostasis. Cell 124, 929–942.

译文:

Zacchigna L.,Vecchione C.,Notte A.,Cordenonsi M.,Dupon S.,Maretto S.,Cifelli G.,Ferrari A.,Maffei A.,Fabbro C.等人(2006)。

Emilin1 links TGF-beta maturation to blood pressure homeostasis《Emilin1将TGF-β成熟与血压动态平衡联系起来》

发表在《细胞》(Cell)杂志第124期,第929–942页。


 

5、德国锡根大学、北京大学和浙江大学联合实证研究简报(2010)

 

拍打拉筋抗糖尿病机理研究简报/王锡宁

拍打拉筋的临床监测报告

监测时间:2010年12月13-18日

监测地点:北京

监测小组: 张长琳(德国siegen大学教授)

王锡宁(北京大学CHQIS课题组,卫生部医院管理研究所研究员)

王维东(浙江大学信息与电子工程学系副教授)

萧宏慈(拍打拉筋技术推广人)

监测对象:33名(志愿者)

监测设备:《身体状态分析仪SAM-2》【德国】

监测方法:利用SAM-2监测人体身心和谐度在拍打前后与拉筋前后及持续一周的瞬间变化与持续变化规律。

拍打拉筋抗糖尿病机理研究简报/王锡宁监测结论1:专家小组使用《身心状态分析仪SAM-2【德】》对拍打拉筋志愿者治疗前后瞬间效果和持续效果监测显示,拍打拉筋治疗前后瞬间效果仪器显示“吸引子集体向上明显变位”,治疗一周后的持续效果仪器显示“吸引子集体向中轴线明显变位”,志愿者的生命质量指标(身心和谐度)和吸引子的空间坐标均发生显著改变,治疗后的生命质量指标变化方向从高度有序态明确迁移到高度和谐态。治疗后的监测指标变化趋势明确显示患者身心状态转向更加健康,拍打拉筋充分改善生命质量有显著效果事实成立!

 

监测结论2:专家组使用《身体状态分析仪SAM-2》【德国】对拍打拉筋治疗前后瞬间效果和持续效果群体观察初步研究结果显示:拍打三分钟,电磁场身体结构波动可以持续激荡二小时。标准拍打拉筋一周,体内制药(自体胰岛素)疗效平均可以维持三个月。停止治疗,吸引子结构呈现聚合、离散交互震荡的规律。有集体数据显示:“拍打3分钟,身心可以持续激荡2小时!”“标准治疗一周,血糖维持正常可持续3个月。”

拍打拉筋抗糖尿病机理研究简报/王锡宁
研究结果:“耗散结构”的科学新发现揭示出西医理论体系存在严重的缺陷。西医的《人体解剖学》准确讲是《尸体解剖学》。人体与尸体的不同是:在化学粒子结构身体之外,还存在有一种只在活体才能观测到的电磁场波动的耗散结构身体,生命的自组织行为是通过耗散结构影响粒子结构表达。“电磁场耗散结构身体”的发现是划时代的医学革命,我们通过《身心状态分析仪SAM-2【德】》已经可以实时动态直视观察到人体 “电磁场耗散结构身体”在拍打拉筋前后的显著结构变化(参见:人的“电磁场耗散结构身体”全球首映式-截图),虽然目前我们的分辨率只有128点象素。事实已经证明,拍打拉筋能够强烈、迅速和持续的改变电磁场身体构造并改善生命质量。

 

 

附件:本期学员表

 

编号

姓名

性别

年龄

血压

身高

体重

1

曹※琴

82

140/50

130/60

160

50.1

49

2

张※云

68

120/75

90/70

158

69.4

66

3

王※捷

56

110/75

130/70

176

63.7

60

4

李※英

37

110/70

120/88

160

62.9

59.5

5

邹※碧

65

150/85

130/80

156

61.4

59.6

6

王※

83

130/60

120/60

171

65.7

62

7

刘※飞

38

110/75

120/70

180

68.3

66

8

郭※红

43

110//65

125/70

168

62.6

59.5

9

随※华

58

120/70

130/80

165

62.9

61.5

10

王※珍

63

150/80

130/80

160

67.1

63

11

侯※森

67

140/88

140/90

174

81.2

75.6

12

张※兰

62

120/75

120/75

160

71.8

69.3

13

林※松

56

 

120/85

170

71.9

69.3

14

屈※波

48

120/90

120/80

170

68.2

64.9

15

贾※瑛

60

150/88

120/85

170

80

76.1

16

姜※文

63

155/95

130/90

155

65.5

62

17

孙※云

61

140/80

110/70

154

55.6

52.7

18

毕※茹

61

130/65

120/60

168

63.8

59.7

19

刘※梅

37

82/58

90/60

156

46

44.5

20

陈※蔷

66

110/70

110/70

162

61.3

58.1

21

王※丽

40

110/75

 

166

50

 

22

迟※苈

65

110/85

105/80

178

76.6

 

23

王※花

48

110/70

110/78

158

61.2

 

24

姜※

37

110/65

110/78

165

55.1

53.9

25

李※琰

80

150/90

138/76

173

73.8

71.5

26

张※

55

125/80

110/70

158

71.5

70

27

张※沫

55

130/90

120/85

168

67.5

64

28

曾※

33

90/50

90/60

153

47.4

46

29

余※萍

57

90/60

90/70

156

49.7

48

30

朱※

46

140/90

120/70

160

73.1

68.1

31

范※捷

45

120/75

138/90

168

70.4

66

32

范※卿

68

140/75

135/75

177

78.3

72.9

33

王※宁

52

120/78

110/80

170

63.5

 

 

 

6、印度金奈TAG VHS 糖尿病研究中心实证研究简报(2015)

拍打拉筋抗糖尿病机理研究简报/王锡宁

摘要,图表,显著的成果

 

1. 此独特的“拍打-拉筋”(“Paida-Lajin”)自愈疗法临床研究体验营在3月9日到3 月13 日在印度金奈的TAG VHS 糖尿病研究中心进行。此来自中国的拍打拉筋自愈疗法的创立人和推广人是萧宏慈老师。这拍打拉筋自愈疗法的整个临床研究是在严谨的医学监督下进行,整个过程都详细地用电脑/视像录影数据记录下来。

 

2. 总共有25名学员参加了5天体验营。萧宏慈老师主张全程7天的疗程参与,但基于安排上的原因,缩短了到5天。萧老师亲自带领他的助手和他印度的同事 Mr Parag Samel 进行体验营。整个体验营在每天早上7点开始,然后进行差不多10到11小时,当中有一小段早餐和午餐的休息时间。整个体验营都是免费的。约10人为住院病人,其他为门诊病人。他们全部都有经过充分的医学筛选;他们的案件都有记录。经过详细的咨询后,所有参与者都同意给予我们整个疗程的知情同意书和摄影记录。25位参加者当中有5位因重要私人原因中途退出。我们有齐完成整个体验营的20位参加者的全程纪录。

 

3.20名参加者表

拍打拉筋抗糖尿病机理研究简报/王锡宁

 

总结和主要信息

 

虽然在一近乎完美条件的环境下推行,但这种删节了的拍打拉筋体验营并不是一治理所有疾病的万能药。但可以证实的是,这方法确实可以真的令努力练习自愈法的实习者带来免于受疾病感染、获得身体健康、热情和精力的祝福,只要每位自愈法练习者对造物主(上帝!)有坚定的信念和信心,明白造物主确实赐予我们一副有智慧的身躯。以下是从体验营获得的几个重要信息。

1. 2型糖尿病 在全面的体验营环境里,2型糖尿病人对拍打拉筋疗法有非常好的反应。这并不令人意外,因这营有一个非常严格的饮食制度,包括断食和意志的控制,和有效地药物。有一积极进取的退休军人在短短的5天体验营内,在没有服用任何之前他在服用的药物情况下,血糖得到控制。亦在体验营一星期后仍可保持非常好的健康。这会为尝试这疗法3到6 个月的新确诊早期2型糖尿病患者(患病少于一年的患者)带来希望。这疗法亦为所有患了糖耐量受损人士带来康复的承诺和成为很多无症状2型糖尿病患者的首选治疗方法。

2. 1型糖尿病 这是更严重,insulinopaenic形式的,在儿童和青少年时期发病的糖尿病,在体验营的5天期间内也记录了临床状况的改善; 然而,在气冲病灶和和在空腹时期当他们的血糖上升的时候,他们需要医疗上的支持,如热量,液体和小剂量的速效胰岛素以防止酮症酸中毒; 但这样的情况并没有危险性,所有的人都复完并完成了全部疗程并获得以新的活力和需要约一半本来所需的胰岛素。长一点的观察期(约6个月)正在进行中,这可能会让我们对这多些了解。

3. 高血压 在整个疗程中,对正在服用不同剂量抗高血压药物的病人来说,停止服用高血压药物并不是一个问题。回到家一个星期后,十个人里面只有一个需要服用本来一半的药量,亦需要就着这人继续疗程而再观察和修订药量。

4. 有四位人士患有不同程度的冠状动脉疾病/ 缺血性心脏疾病,但没有任何一位在这艰苦的体验营时发生任何问题。在这么短的时间内不能评拍打拉筋在心脏疾病的疗效。我们要一个较长时期研究一个更大的样本,以评估这疗法对此病况的全部益处。

5. 不严重但慢性的疾病,如膝盖疼痛(OA),髋痛(OA),腰背酸痛,肩周炎,退化性脊椎炎(spondylitis),腰盘突出等都可以获得容易、显著、和高度的成功治疗效果(98%)。

6. 在这研究里,拍打拉筋真正的效果和发现是它在帕金森病症上近乎戏剧性的的疗效。拍打拉筋可以让一帕金森病人减少和另一帕金森病人完全停止服用抗帕金森药物。这提供了一线肯定的希望给予全世界千千万万不同类型的帕金森病人,和受着这些药物副作用影响的病人

(a) 运动障碍等不良反应。拍打拉筋带来的活动能力是无与伦比的,观看/演示(video 视频图)很令人兴奋。此次研究体验营肯定显示了治疗帕金森氏病是乐观和有希望的。我相信系统化的,大型的,长约3年的研究会显现拍打拉筋对他们生命上所可以带来的益处。

7. 最后的重要信息是,拍打拉筋的确双倍增加了所有参加者(100%)的精力,无论是单独的,或是“全体性效应”的,它都给了乐观和希望给所有有这些信念的人- 保持健康比治病重要,自愈比寻找药物重要,和对未知/虚幻风险的恐惧会让自信幻灭。

 

鸣谢:

  • Prof. S. Suresh, Hon. Secretary, Voluntary Health Services, 展开临床研究体验营和延长所有的症状。
  • Dr. M. S. Swaminathan, President V.H.S. 主持的 TAG VHS DRC 第四届的会议和他一贯的鼓励和支持。
  • Prof. B.M. Hedge Co-Chairman, TAG VHS DRC and Former Vice Chancellor Manipal University, 他的精彩主题演讲和持续支持创新性的研究。
  • Mr. D. Parthasarathy 和他的家族 ( Dollar Company, Chennai) , 他们宽宏的大量和鼓励 TAG VHS DRC 的临床研究工作。
  • Shri. L. Sabaretnam Chairman, 和他 Bharathi Vidya Bhavan 的团队 - Chennai Kendre 所有的支持和合作,让第四届日庆祝活动可以顺利成功地在 Bhavan's Dr. Preetha Reddy Auditorium 进行。

 

拍打拉筋抗糖尿病机理研究简报/王锡宁



 

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