小鼠冠状动脉内皮细胞的基本特性与培养方法及研究应用！

 

小鼠冠状动脉内皮细胞（Mouse Coronary Artery Endothelial Cells, MCAECs）是位于小鼠冠状动脉血管壁最内层的单层扁平上皮细胞，是维持冠状动脉正常生理功能、调节心肌血流灌注的关键细胞类型，也是心血管疾病研究中的重要体外模型。以下从细胞基本特性、分离培养方法、研究应用、关键注意事项四个维度展开详细说明，为科研实验提供参考。

 

一、细胞基本特性

 

MCAECs 兼具血管内皮细胞的通用特征，同时因所处“冠状动脉微环境”（需耐受心肌收缩压力、维持心肌高氧供需求）而具有独特表型和功能：

 

1、形态学特征

 

典型形态：贴壁培养时呈鹅卵石样单层排列，细胞扁平、形态规则，胞核清晰居中（圆形或椭圆形），边缘可见轻微突起（与相邻细胞形成连接）；

 

特异性结构：胞膜表面富含血管内皮钙黏蛋白形成的紧密连接（维持血管屏障功能），胞质内含有小体（储存血管性血友病因子 vWF，参与凝血调节），部分细胞可见微小窗孔（适应心肌代谢对物质交换的高需求）。

 

2、核心表型标志物（鉴定依据）

 

MCAECs 的特异性标志物是实验中确认细胞纯度的关键，需通过免疫荧光、流式细胞术验证，常用标志物如下：

 

标志物类型          具体分子       功能与鉴定意义

 

通用内皮标志物 血管性血友病因子 内皮细胞特异性分泌蛋白，小体的核心成分，阳性率需≥95%（排除非内皮细胞污染）

 

血小板内皮细胞黏附分子  跨膜黏附蛋白，参与细胞间连接，几乎所有内皮细胞均表达，可作为内皮细胞的 “通用标签”

 

血管床特异性标志物  内皮型一氧化氮合酶  冠状动脉内皮细胞高表达，催化生成 NO（调节血管舒张，维持心肌血流）

 

血栓调节蛋白（TM）  细胞膜表面抗凝蛋白，冠状动脉内皮细胞特异性高表达，可排除平滑肌细胞、成纤维细胞污染

 

阴性对照标志物  α- 平滑肌肌动蛋白 平滑肌细胞标志物，MCAECs 应呈阴性（若阳性提示平滑肌细胞污染，需进一步纯化）

 

3、主要生理功能

 

MCAECs 的功能直接关联冠状动脉健康和心肌供血，核心功能包括：

 

屏障功能：通过 VE-cadherin 介导的紧密连接，维持血管壁完整性，阻止血液中大分子物质（如脂质、炎症细胞）异常渗透至血管壁（预防动脉粥样硬化起始）；

 

血管舒缩调节：通过 eNOS 生成一氧化氮（NO），激活平滑肌细胞内 cGMP 通路，导致血管舒张，调节冠状动脉血流量（适应心肌在运动、缺血时的氧供需求）；

 

抗凝与抗炎：表达 TM、蛋白 C 受体等抗凝分子，抑制凝血酶激活；分泌前列环素，抑制血小板聚集；同时通过调节黏附分子表达，控制炎症细胞黏附（减少心肌炎症损伤）；

 

物质交换：通过细胞膜窗孔和载体蛋白，介导血液与心肌细胞间的氧气、营养物质（如葡萄糖、脂肪酸）及代谢废物（如乳酸）交换，维持心肌正常代谢。

 

二、细胞分离与培养方法（常用流程）

 

MCAECs 的分离需兼顾“高纯度”和“高活性”，核心是通过酶解消化冠状动脉组织、排除杂细胞污染，以下为经典的小鼠冠状动脉内皮细胞分离培养步骤（适用于 C57BL/6 等常用近交系小鼠）：

 

1、实验前准备

 

动物：选择 6-8 周龄健康小鼠（雌雄均可，体重 20-25g，避免老年小鼠，因血管弹性下降导致内皮细胞活力降低）；

 

试剂：

 

消化液：0.1% 胶原酶 II（Sigma，需用无血清 DMEM 稀释，37预热）、0.25% 胰蛋白酶 - EDTA（仅用于后续杂细胞去除）；

 

培养基：内皮细胞专用培养基（如 ECGM，添加 5% 胎牛血清 FBS、1% 内皮细胞生长因子 ECGS、1% 青霉素 - 链霉素双抗，避免使用含高浓度血清的培养基，防止成纤维细胞过度增殖）；

 

其他：无菌 PBS（pH7.2-7.4）、4% 多聚甲醛（固定细胞）、无菌手术器械（显微剪刀、镊子、血管夹）。

 

器材：超净工作台、CO2 培养箱（37，5% CO2，湿度 95%）、倒置显微镜、离心管（15mL/50mL）、培养皿（6 孔 / 12 孔，提前用明胶包被：0.1% 明胶溶液室温孵育 30 分钟，弃去后晾干，增强内皮细胞贴壁能力）。

 

2、分离步骤（关键：精准获取冠状动脉组织）

 

小鼠心脏取材：

 

小鼠经颈椎脱臼法处死（需符合动物伦理规范），75% 乙醇浸泡消毒 5 分钟；

 

无菌条件下开胸，暴露心脏，用血管夹夹住主动脉根部，快速剪下心脏（避免损伤冠状动脉主干），放入预冷的无菌 PBS 中（洗去表面血液）。

 

冠状动脉灌注与酶解：

 

将心脏固定于灌注装置上，从主动脉根部缓慢注入 37预热的 0.1% 胶原酶 II 溶液（灌注压力控制在 80-100mmHg，避免压力过高损伤内皮细胞），同时用显微镜观察冠状动脉分支是否充盈（当血管呈半透明状时，提示酶液已充分渗透）；

 

灌注后，将心脏放入含胶原酶 II 的离心管中，37水浴振荡消化 15-20 分钟（每隔 5 分钟轻轻吹打 1 次，促进内皮细胞脱落）。

 

细胞收集与纯化：

 

消化结束后，加入等体积含 FBS 的 ECGM 培养基终止消化，用 100μm 细胞筛过滤（去除未消化的组织碎片），收集滤液；

 

1000rpm 离心 5 分钟，弃上清，用 ECGM 重悬细胞，接种至明胶包被的 6 孔板中，37 CO2 培养箱培养 24 小时（此时杂细胞如平滑肌细胞、成纤维细胞也会贴壁）；

 

24 小时后，用无菌 PBS 轻轻洗板 2 次（去除未贴壁的死细胞），更换新鲜 ECGM；待细胞融合至 70% 时，加入 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化 30 秒（内皮细胞贴壁较松，优先脱落，而平滑肌细胞贴壁紧密，可通过短时间消化实现初步纯化）；

 

收集脱落的细胞，再次接种至新的明胶包被板中，继续培养（若需更高纯度，可采用免疫磁珠分选法：用 CD31 抗体偶联的磁珠，特异性捕获 CD31 + 内皮细胞，纯度可达 98% 以上）。

 

3、培养与传代注意事项

 

传代时机：当细胞融合至 80-90% 时进行传代（避免过度融合导致细胞分化，失去内皮细胞特性），传代比例为 1:2（每瓶传 2 瓶，密度过低易导致细胞凋亡）；

 

培养基更换：常规每 2-3 天更换 1 次 ECGM，若发现培养基变黄（pH 下降）或有污染迹象（如出现漂浮物、培养基浑浊），需立即更换；

 

细胞状态观察：正常 MCAECs 呈鹅卵石样排列，若出现梭形细胞增多、eNOS 表达下降，提示细胞已老化或分化，需弃用（建议传代次数不超过 5 代，超过 5 代后细胞功能易丢失）。

 

三、主要研究应用

 

MCAECs 因与人类冠状动脉内皮细胞的生理功能高度相似，且小鼠模型可通过基因编辑实现特定基因调控，成为心血管领域的核心研究工具，主要应用场景如下：

 

1、动脉粥样硬化机制研究

 

模拟人类冠状动脉粥样硬化的起始过程：在体外培养体系中加入氧化低密度脂蛋白，观察 MCAECs 的屏障功能变化、炎症黏附分子表达上调情况，探索脂质损伤内皮细胞的分子机制；

 

基因功能验证：利用 CRISPR/Cas9 技术敲除 MCAECs 中的候选基因，观察细胞对 ox-LDL 的摄取能力及炎症反应变化，明确该基因在动脉粥样硬化中的作用。

 

2、心肌缺血再灌注损伤（IRI）研究

 

体外模拟缺血环境：将 MCAECs 置于低氧培养箱（1% O2）中培养 4 小时（模拟缺血），再恢复正常氧浓度（21% O2）培养 2 小时（模拟再灌注），构建缺血再灌注模型；

 

研究细胞损伤机制：检测模型中 MCAECs 的凋亡率、NO 生成量（eNOS 活性变化）、氧化应激水平（ROS 检测），探索再灌注后内皮细胞损伤的关键通路，同时筛选保护内皮细胞的药物。

 

3、高血压相关血管重构研究

 

模拟高血压环境：用血管紧张素 II（Ang II）处理 MCAECs，观察细胞增殖、迁移能力变化，以及细胞外基质（如胶原 I、纤连蛋白）的分泌情况，探索高血压导致冠状动脉壁增厚、管腔狭窄的内皮细胞机制；

 

验证降压药物的内皮保护作用：检测降压药对 Ang II 诱导的 MCAECs 功能异常的逆转效果，为药物研发提供体外数据支持。

 

4、血管生成与心肌修复研究

 

体外血管生成实验：将 MCAECs 接种至 Matrigel 基质胶上，观察细胞形成管腔样结构的能力（血管生成的关键指标），研究促血管生成因子对 MCAECs 的调控作用；

 

心肌梗死修复研究：将体外培养的 MCAECs 与干细胞（如间充质干细胞）共培养，观察干细胞对 MCAECs 血管生成能力的影响，为心肌梗死术后的血管再生治疗提供实验依据。

 

四、关键注意事项（确保实验可靠性）

 

1、细胞纯度鉴定是前提：

 

每批次分离的 MCAECs 必须通过免疫荧光验证 vWF、CD31、eNOS 的阳性率（需≥95%），同时确认 α-SMA 阴性（排除平滑肌细胞污染），否则会导致实验结果偏差（如杂细胞分泌的细胞因子干扰内皮细胞功能检测）。

 

2、避免细胞活化或损伤：

 

分离过程中需严格控制酶解时间和温度（胶原酶消化超过 25 分钟会导致细胞活力下降），灌注压力需稳定（压力过高会破坏内皮细胞紧密连接）；

 

培养过程中避免反复操作（如频繁换液、剧烈吹打），防止细胞活化（如异常表达，模拟炎症状态，影响基础功能检测）。

 

3、实验分组与对照设计：

 

需设置空白对照（未处理的 MCAECs）、阴性对照（仅加溶剂，如 PBS）、阳性对照（已知作用的药物，如用 VEGF 作为促血管生成阳性对照），确保实验结果的可比性；

 

若使用基因编辑小鼠的 MCAECs，需同时设置野生型小鼠的 MCAECs 作为对照，排除遗传背景差异的影响。

 

4、伦理与安全规范：

 

小鼠实验需经机构动物伦理委员会审批（遵循 3R 原则：替代、减少、优化），处死过程需符合无痛化要求；

 

细胞培养过程中需严格无菌操作，避免支原体、细菌污染（可定期用支原体检测试剂盒排查，污染的细胞需立即灭活处理，不可随意丢弃）。

 

五、总结

 

小鼠冠状动脉内皮细胞是研究冠状动脉生理功能及心血管疾病机制的“理想体外模型”，其分离培养的核心是“精准获取组织 + 高效纯化 + 维持细胞表型”，实验应用中需结合具体研究方向（如动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤）设计合理的模型，并通过严格的质控（纯度鉴定、对照设置）确保结果的可靠性。同时，需注意小鼠与人类冠状动脉结构的差异（如小鼠冠状动脉分支更细，内皮细胞对药物的反应可能存在物种差异），实验结论需结合体内模型进一步验证。

 

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