小鼠视网膜微血管周细胞体外培养的具体操作流程！

 

小鼠视网膜微血管周细胞的体外培养是获取高纯度、高活性细胞用于实验研究的关键技术，其具体步骤需严格控制无菌操作、消化条件及纯化方法，以保证细胞质量。以下是详细的体外培养流程：

 

一、实验准备

 

材料与试剂

 

实验动物：选取健康的成年小鼠，体重 20-25g，雌雄不限。

 

核心试剂：DMEM/F12 基础培养基、胎牛血清（FBS，终浓度 10%）、青霉素 - 链霉素双抗（终浓度 100U/mL 青霉素 + 100μg/mL 链霉素）、中性蛋白酶、胶原酶 型（终浓度 1mg/mL）、胰蛋白酶 - EDTA 消化液（0.25% 胰酶 + 0.02% EDTA）、PBS 缓冲液（pH7.2-7.4）、牛血清白蛋白（BSA，终浓度 1%）。

 

实验器材：超净工作台、CO培养箱（5% CO，37）、离心机、倒置显微镜、无菌眼科剪、眼科镊、培养皿（35mm/60mm）、离心管（15mL/50mL）、移液枪及无菌枪头。

 

预处理

 

所有实验器材经高压蒸汽灭菌，试剂经滤膜过滤除菌；超净工作台提前 30min 开启紫外消毒，同时预热培养基、PBS 至 37。

 

小鼠提前禁食 12h，减少眼部组织脂肪干扰。

 

二、视网膜组织分离

 

小鼠经颈椎脱臼法处死，立即放入 75% 乙醇中浸泡 5min，进行全身消毒。

 

在超净工作台内，用无菌眼科镊固定小鼠头部，眼科剪剪开眼睑，暴露眼球，轻轻摘除眼球，放入含双抗的 PBS 缓冲液中冲洗 3 次，去除表面杂质。

 

将眼球转移至新的无菌培养皿，加入少量 PBS，用眼科剪沿眼球赤道部剪开，去除眼前节（角膜、晶状体、虹膜），保留眼后节（视网膜、脉络膜、巩膜）。

 

用眼科镊轻轻剥离视网膜组织（呈半透明薄膜状），避免携带脉络膜和巩膜组织，将分离的视网膜放入含 1% BSA 的 PBS 中，反复冲洗 2 次。

 

三、组织消化与细胞分散

 

将视网膜组织转移至 15mL 离心管，加入预温的中性蛋白酶 - 胶原酶混合消化液（体积根据组织量调整，一般每只眼球的视网膜加入 1-2mL），置于 37水浴锅中振荡消化 30-40min，期间每 10min 轻轻颠倒离心管 1 次，促进消化均匀。

 

消化结束后，加入等体积含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基终止消化，用移液枪反复吹打 10-15 次，使组织块分散为单细胞悬液。

 

用 200 目无菌细胞筛过滤单细胞悬液，去除未消化的组织碎片，收集过滤后的细胞悬液。

 

四、细胞接种与原代培养

 

将过滤后的细胞悬液转入离心管，1000r/min 离心 5min，弃上清液，加入 2mL 含 10% FBS 和双抗的 DMEM/F12 完全培养基，轻轻吹打重悬细胞。

 

取少量细胞悬液，用台盼蓝染色计数，调整细胞浓度至 5×10个 /mL，接种至预先包被明胶（0.1% 明胶溶液，37包被 30min 后吸弃）的 60mm 培养皿中，每皿加入 3mL 细胞悬液。

 

将培养皿放入 CO培养箱，37、5% CO、饱和湿度条件下培养，前 3 天不换液，让细胞贴壁生长。

 

五、细胞纯化

 

原代培养的细胞中可能混杂内皮细胞、成纤维细胞等，需通过差速贴壁法或免疫磁珠分选法纯化周细胞：

 

差速贴壁法（常用）：原代培养第 4 天，轻轻吸弃上清液，加入新鲜完全培养基，继续培养 24h；此时成纤维细胞贴壁能力强，内皮细胞贴壁较弱，周细胞介于两者之间。吸弃上清液，用 PBS 冲洗 2 次，加入 0.25% 胰酶 - EDTA 消化液，在倒置显微镜下观察，当周细胞开始皱缩、脱落时（约 1-2min），立即加入培养基终止消化，收集细胞悬液离心后重新接种，重复 2-3 次可提高周细胞纯度。

 

免疫磁珠分选法（高纯度需求）：利用周细胞特异性标志物的抗体偶联磁珠，与细胞悬液孵育后，通过磁力分选仪分离阳性细胞，获得高纯度周细胞。

 

六、传代培养

 

当原代或纯化后的周细胞生长至培养皿底面积的 80%-90% 时，进行传代。

 

吸弃上清液，用 PBS 冲洗细胞表面 2 次，去除残留培养基；加入适量胰酶 - EDTA 消化液，覆盖细胞层，37孵育 2-3min，倒置显微镜下观察到细胞完全脱落后，加入 2 倍体积的完全培养基终止消化。

 

用移液枪反复吹打培养皿底部，使细胞完全分散，收集细胞悬液 1000r/min 离心 5min，弃上清。

 

加入新鲜完全培养基重悬细胞，按 1:2 的比例接种至新的培养皿中，放入培养箱继续培养，每 3-4 天换液一次。

 

七、细胞鉴定与质量控制

 

形态学鉴定：倒置显微镜下观察，纯化后的周细胞呈不规则三角形或梭形，有多个长突触，贴壁生长，形态均一，无明显杂细胞。

 

免疫细胞化学鉴定：采用细胞爬片法，对细胞进行免疫荧光染色，周细胞特异性标志物呈阳性表达，内皮细胞标志物呈阴性，可确认细胞纯度。

 

活性检测：台盼蓝染色法检测细胞活性，活性率需高于 90%；通过 CCK-8 法绘制生长曲线，观察细胞增殖能力，确保细胞功能正常。

 

八、注意事项

 

全程严格无菌操作，避免细菌、真菌污染；实验过程中尽量缩短组织暴露在空气中的时间，减少细胞损伤。

 

消化时间需严格控制，避免消化过度导致细胞死亡，或消化不足导致组织块残留。

 

周细胞体外培养一般可传 1-2 代，传代次数过多会导致细胞表型改变，建议使用早期代次细胞进行实验。

 

培养基需定期更换，及时清除代谢废物，保证细胞营养供应；培养环境的温度、CO浓度需稳定，避免波动影响细胞生长。

 

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