真菌原生质体制备技术的核心原理与操作流程及优化策略！

 

百欧博伟生物：真菌原生质体制备技术是真菌遗传操作（如原生质体融合、转化、基因编辑）、生理研究及次生代谢产物开发的核心技术之一，其核心是通过酶解去除真菌细胞壁，获得具有活性的原生质体（仅由细胞膜包裹细胞质的裸细胞）。该技术的关键在于细胞壁高效酶解与原生质体活性维持，需根据真菌种类（如酵母菌、丝状真菌、担子菌）的细胞壁结构差异优化方案，具体流程可分为以下 5 个核心步骤，同时需注意关键影响因素的控制：

 

一、技术核心原理

 

真菌细胞壁主要由多糖 、少量蛋白质和脂质组成，不同类群成分差异显著（如酵母菌以甘露聚糖 - 葡聚糖为主，丝状真菌以几丁质 - 葡聚糖为主）。原生质体制备的本质是利用专一性酶系（如几丁质酶、葡聚糖酶）降解细胞壁多糖，同时通过渗透压稳定剂（如蔗糖、山梨醇）维持原生质体形态（避免吸水破裂或失水皱缩），最终获得完整、有活性的原生质体。

 

二、详细操作流程

 

1、菌株选择与预处理（奠定酶解基础）

 

菌株选择：优先选择对数生长期的细胞 / 菌丝—— 此时细胞代谢活跃、细胞壁结构疏松，酶解效率最高。

 

酵母菌：培养至 OD=0.6-0.8 的对数期（约 12-16h，液体摇瓶培养）；

 

丝状真菌：培养 3-5d 的菌丝体（固体平板或液体深层培养，选择幼嫩菌丝，避免老化菌丝细胞壁增厚）。

 

预处理：针对部分细胞壁结构紧密或含次生代谢产物（如色素、蜡质）的菌株，需通过预处理削弱细胞壁，提高酶解效率：

 

化学预处理：用 0.01-0.1mol/L EDTA（乙二胺四乙酸） 螯合细胞壁中的 Ca²、Mg²（破坏细胞壁交联结构），或用 0.1%-1% β- 巯基乙醇 破坏细胞壁蛋白质的二硫键；

 

物理预处理：对丝状真菌可采用研磨破碎菌丝（避免过度研磨损伤细胞），或用超声波（低功率，100-300W）轻微处理，破坏菌丝束结构。

 

2、酶解体系构建（关键步骤）

 

酶解是原生质体制备的核心，需根据真菌细胞壁成分选择复合酶系，并优化酶解条件以平衡“酶解效率”与“原生质体活性”。

 

真菌类型    推荐酶系（复合使用）   酶浓度（终浓度）  酶解条件（温度 /pH）  酶解时间

 

酵母菌（如酿酒酵母） 甘露聚糖酶 + 葡聚糖酶 + 纤维素酶 1-5mg/mL 28-30 / pH 5.5-6.0 1-3h

 

丝状真菌（如曲霉） 几丁质酶 + 葡聚糖酶 + 蜗牛酶（辅助降解蛋白质） 2-8mg/mL 30-32 / pH 5.0-5.8 2-6h

 

担子菌（如香菇） 几丁质酶 + 纤维素酶 + 果胶酶 3-10mg/mL 25-28 / pH 4.8-5.5 4-8h

 

渗透压稳定剂选择：需与真菌细胞内渗透压匹配，常用类型包括：

 

高渗糖类：0.6-1.2mol/L 蔗糖（丝状真菌首选）、0.8-1.0mol/L 山梨醇（酵母菌首选）；

 

盐类：0.5-0.8mol/L KCl 或 NaCl（适用于耐盐真菌，成本较低，但需注意盐浓度对酶活性的影响）。

 

酶解操作：将预处理后的细胞 / 菌丝按 10-10个 /mL 的密度悬浮于酶解液中，置于摇床（50-100r/min，温和振荡） 或恒温水浴中酶解，期间需定时取样观察（显微镜下观察原生质体释放情况），避免酶解过度导致原生质体破裂。

 

3、原生质体分离与纯化（去除杂质）

 

酶解后体系中含未酶解的菌丝碎片、残留酶液及杂质，需通过以下步骤纯化：

 

过滤除渣：用 200-400 目尼龙网过滤酶解液，去除未酶解的菌丝块（避免干扰后续离心）；

 

低速离心收集：将过滤液置于离心管中，以500-1000×g 离心 5-10min（转速过高会导致原生质体破裂），弃上清（含残留酶和杂质）；

 

洗涤纯化：用预冷的渗透压稳定剂重悬沉淀，重复离心 2-3 次，最终获得纯净的原生质体沉淀。

 

4、原生质体质量检测（确保活性与完整性）

 

制备后需通过 3 项核心指标评估原生质体质量，以满足后续实验需求：

 

产量检测：用血球计数板计数，计算公式：原生质体产量（个 /mL）= 计数室平均细胞数 × 稀释倍数 × 10；优质制备量通常需达到 10-10个 /mL；

 

活性检测：采用台盼蓝染色法（活原生质体细胞膜完整，不吸收染料，呈无色；死细胞呈蓝色），活性需≥80% 方可用于后续实验；

 

完整性检测：显微镜（400×）观察，活的原生质体呈球形、透亮、无明显破损，若出现不规则形态或内容物泄漏，说明制备失败。

 

5、原生质体保存（短期或长期使用）

 

短期保存：将纯化后的原生质体悬浮于渗透压稳定剂中，置于4冰箱，可保存 1-2d（活性会逐渐下降，需尽快使用）；

 

长期保存：加入 10%-20% 甘油作为保护剂，置于-80冰箱或液氮（-196）中，可保存数月至数年（解冻时需快速水浴升温至 37，避免反复冻融）。

 

三、关键影响因素与优化策略

 

原生质体制备成功率受多种因素影响，需针对具体菌株优化：

 

菌株遗传背景：不同菌株的细胞壁厚度、多糖组成差异大（如同一属的不同曲霉，几丁质含量可能相差 20%），需通过预实验筛选适合的酶系；

 

酶的纯度与活性：优先选择商用高活性酶，避免使用失活酶（酶活性可通过 DNS 法检测还原糖释放量评估）；

 

渗透压平衡：稳定剂浓度过低会导致原生质体吸水破裂，过高则导致失水皱缩，需通过梯度实验（如 0.4、0.6、0.8mol/L 蔗糖）确定最佳浓度；

 

酶解时间：酶解不足会导致产量低，过度则会破坏原生质体膜，需定时取样观察（通常在酶解 1h 后，每 30min 观察一次）。

 

四、技术应用场景

 

制备的活性原生质体可用于多种下游研究：

 

遗传育种：原生质体融合（跨越种间屏障，培育高产菌株，如工业发酵用的青霉素高产曲霉）；

 

基因操作：原生质体转化（将外源基因导入真菌细胞，如酵母表达载体的转化）；

 

生理研究：研究细胞膜功能、细胞壁合成机制，或用于原生质体再生实验（观察细胞壁重建过程）；

 

次生代谢：部分真菌原生质体可在体外诱导产生更高产量的次生代谢产物（如抗生素、真菌毒素）。

 

综上，真菌原生质体制备技术的核心是“针对性酶解”与“渗透压控制”，需根据真菌种类优化流程，同时严格把控质量检测环节，才能获得高质量的原生质体，为后续实验奠定基础。

 

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