如何筛选具有高效防病促生作用的皮尔瑞俄类芽胞杆菌菌株？

 

百欧博伟生物：筛选具有高效防病促生作用的皮尔瑞俄类芽胞杆菌（Paenibacillus peoriae）菌株，需结合其生理特性、功能靶点（防病 / 促生）及实际应用场景，通过“分离纯化→初筛→复筛→综合验证”的阶梯式流程实现，核心是确保筛选指标与“高效性”“稳定性”“实用性”匹配。以下是详细筛选方案：

 

一、筛选前准备：明确核心目标与关键指标

 

在筛选前需定义“高效”的量化标准，避免盲目筛选。参考农业应用需求，核心指标如下：

 

功能类型          关键指标（量化标准）      备注

 

高效防病 1.对目标病害的离体抑菌率≥70%；2.活体盆栽防效≥60%；3.能稳定产生抑菌物质 需覆盖 1-2 种主要靶标致病菌

 

高效促生 1.产生长素≥50 μg/mL；2.固氮能力≥10 mg N/g 底物；3.溶磷量≥200 μg/mL； 促生指标需结合目标作物的需求

 

实用性 1.生长温度适应范围广；2.耐酸碱、耐低盐；3.传代 5 次后功能保留率≥80% 确保菌株能适应田间环境及工业化生产

 

二、第一步：菌株分离纯化 —— 从“高潜力生境”富集目标菌

 

皮尔瑞俄类芽胞杆菌多存在于植物根际土壤、健康植物组织（内生）、病害发生区的抗病植株根际（长期自然选择下易富集抗病菌株），需优先从这些生境采样，提高筛选效率。

 

1、样品采集

 

采样生境：优先选择 3 类场景：

 

连作障碍田（如黄瓜、番茄田）中“健康植株根际土”（可能富集拮抗病原菌的菌株）；

 

已发生目标病害的田块中“抗病单株的根际 / 茎秆内生”（菌株可能已形成对病原菌的竞争优势）；

 

有机种植田的作物根际（减少化学农药对菌株的抑制，保留多样功能菌）。

 

采样方法：根际土需取“植株根系附着的 0-10 cm 表层土”，去除杂质后装无菌袋；内生菌需取茎秆 / 根系，表面消毒（75% 乙醇 30s→0.1% HgCl 1min→无菌水冲洗 3 次）后研磨。

 

2、分离纯化（基于生理特性的选择性富集）

 

利用皮尔瑞俄类芽胞杆菌“好氧、耐一定温度、革兰氏阳性”的特性，通过选择性培养基 + 温度胁迫排除杂菌：

 

富集培养：将样品（根际土 10g / 内生组织研磨液）加入含 100mL NA 培养基（营养琼脂） 的三角瓶，30、180rpm 振荡培养 24h（好氧富集）；之后取 1mL 培养液，在 80水浴中处理 10min（杀死非芽胞菌，保留类芽胞杆菌的芽胞）。

 

稀释涂布：将热处理后的菌液梯度稀释（10~10），取 0.1mL 涂布于PA 培养基（选择性培养基，含 5μg/mL 氨苄青霉素，抑制革兰氏阴性菌） ，30倒置培养 48h。

 

单菌落纯化：观察菌落形态（皮尔瑞俄类芽胞杆菌典型菌落：圆形、表面光滑、乳白色、边缘整齐，直径 2-3mm），挑取符合形态的单菌落，在 NA 平板上划线纯化 3 次，获得纯菌株。

 

三、第二步：初筛 —— 快速排除无功能菌株（低成本、高通量）

 

初筛以“表型特征 + 基础功能”为核心，通过简单实验快速筛选出具有“防病 / 促生潜力”的菌株，减少后续复筛的工作量。

 

1、菌株身份验证：排除非目标菌

 

初筛阶段需先确认菌株为Paenibacillus peoriae，避免错筛：

 

形态与生理验证：革兰氏染色（阳性，杆状）、鞭毛染色（周生多鞭毛）、运动性观察（半固体培养基穿刺，可见扩散生长）；

 

分子鉴定：提取菌株基因组 DNA，扩增16S rRNA 基因（通用引物 27F/1492R）和类芽胞杆菌属特异性基因gyrB（引物 gyrB-F/gyrB-R），测序后与 NCBI 数据库中P. peoriae 模式菌株比对，同源性≥99% 可确认为目标菌。

 

2、防病潜力初筛：离体抑菌实验（高通量）

 

采用“平板对峙法 / 抑菌圈法”，快速检测菌株对靶标病原菌的拮抗能力：

 

靶标病原菌选择：根据目标作物确定，如针对蔬菜可选：

 

细菌性病原菌：黄瓜细菌性软腐病菌（Erwinia carotovora）、番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）；

 

真菌性病原菌：黄瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、西瓜蔓枯病菌（Didymella bryoniae）。

 

实验方法：

 

平板对峙法：在 PDA 平板中央接种病原菌菌饼（直径 5mm），距中央 2.5cm 处接种纯化的皮尔瑞俄类芽胞杆菌（点接，直径 2mm），30培养 3-5d，测量“抑菌圈宽度”（病原菌菌落与细菌菌落间的空白距离），宽度≥5mm 为有潜力菌株；

 

抑菌圈法：将病原菌菌悬液（10 CFU/mL）均匀涂布于 PDA/NA 平板，放置无菌牛津杯（直径 8mm），加入 100μL 皮尔瑞俄类芽胞杆菌发酵液（30振荡培养 48h，离心取上清），培养后测量抑菌圈直径，直径≥15mm 为高效潜力菌株。

 

3、促生潜力初筛：基础促生特性检测

 

针对“产 IAA、固氮、溶磷”3 个核心促生功能，采用定性 / 半定量方法初筛：

 

产 IAA 检测（Salkowski 比色法）：将菌株接种于含 L - 色氨酸（1g/L）的 LB 液体培养基，30振荡培养 48h，取上清 1mL+2mL Salkowski 试剂（50mL 35% HClO + 1mL 0.5mol/L FeCl），避光反应 30min，若溶液呈粉红色，说明产 IAA（颜色越深，产量越高）；

 

固氮能力检测（无氮培养基培养）：将菌株接种于Ashby 无氮培养基（不含氮源，仅含碳源和矿物质），30培养 7d，能正常生长（菌落直径≥2mm）说明具有固氮潜力；

 

溶磷能力检测（溶磷圈法）：将菌株接种于Pikovaskaia 溶磷培养基（含难溶性磷酸钙，pH 7.0），30培养 7d，观察菌落周围是否出现透明溶磷圈，计算“溶磷圈直径 / 菌落直径比值（D/d）”，比值≥2.0 为高效溶磷潜力菌株。

 

四、第三步：复筛 —— 精准量化功能，筛选“高效菌株”

 

初筛获得的菌株需通过定量检测 + 活体验证，排除“离体有效、活体无效”或“功能不稳定”的菌株，核心是“量化高效性 + 验证稳定性”。

 

1、防病功能复筛：从“离体”到“活体”，验证实际防效

 

第一步：抑菌物质定量与类型分析

 

对初筛高抑菌活性菌株，发酵后通过“高效液相色谱（HPLC）”检测其特征抑菌物质的含量（参考标准品峰面积定量），同时通过“蛋白酶 K 处理发酵液”（若抑菌活性下降，说明抑菌物质含蛋白质 / 多肽）、“酸碱处理（pH 2-10）”（验证抑菌物质稳定性），确保菌株能稳定产抑菌物质。

 

第二步：活体盆栽防效实验

 

以目标作物（如黄瓜、番茄）为材料，分 3 组处理：

 

对照组：仅接种病原菌；

 

菌株处理组：先灌根 / 喷雾皮尔瑞俄类芽胞杆菌菌悬液（10 CFU/mL），24h 后接种病原菌；

 

空白组：不接菌。

 

培养 15-20d 后，统计“病株率”“病情指数”，计算防效 =（对照组病情指数 - 处理组病情指数）/ 对照组病情指数 ×100% ，防效≥60% 为高效防病菌株。

 

2、促生功能复筛：从“实验室指标”到“植物表型”，验证促生实效

 

第一步：促生物质定量检测

 

对初筛阳性菌株，采用“高效液相色谱（HPLC）”精准定量 IAA 产量（需用 IAA 标准品绘制标准曲线）；采用“钼蓝比色法”定量溶磷量（检测发酵液中可溶性磷含量）；采用“凯氏定氮法”定量固氮量（检测无氮培养基中菌株固定的氮含量），确保指标达到“高效”标准。

 

第二步：活体促生实验

 

以无菌基质（如蛭石 + 珍珠岩 = 3:1）培养目标作物（如玉米、黄瓜），分 2 组处理：

 

处理组：每株灌根 10mL 皮尔瑞俄类芽胞杆菌菌悬液（10 CFU/mL）；

 

对照组：灌根 10mL 无菌培养基。

 

培养 20-30d 后，测定“株高、根长、地上部鲜重、地下部鲜重”，计算促生率 =（处理组指标 - 对照组指标）/ 对照组指标 ×100% ，至少 2 项指标促生率≥20% 为高效促生菌株。

 

3、环境适应性与遗传稳定性验证

 

环境适应性：将菌株接种于不同条件的 NA 培养基（温度 5/15/30/40；pH 5.0/6.0/7.0/8.0；NaCl 浓度 1%/2%/3%），培养 48h 后测 OD（菌体浓度），确保在多数农田环境下（如低温 15、pH 6-8）能正常生长（OD≥1.0）；

 

遗传稳定性：将菌株连续传代 10 次，每次传代后检测“抑菌率”“IAA 产量”，若功能保留率≥80%，说明遗传稳定（避免工业化生产中功能丢失）。

 

五、第四步：综合评价与筛选 —— 确定最终高效菌株

 

通过上述步骤后，需对菌株进行多维度综合评分，筛选出“防病 - 促生 - 适应性”均优的菌株，评分标准参考如下：

 

评价维度 权重 评分标准（100 分制）

 

防病能力 30% 活体防效≥70%（30 分）；60-70%（20 分）；<60%（0 分）

 

促生能力 30% 2 项指标促生率≥25%（30 分）；1 项≥25%+1 项≥20%（20 分）；<20%（0 分）

 

环境适应性 20% 40/pH 5.0/3% NaCl 下均能生长（20 分）；2 项达标（10 分）；1 项达标（5 分）

 

遗传稳定性 20% 传代 10 次功能保留率≥90%（20 分）；80-90%（10 分）；<80%（0 分）

 

最终筛选标准：综合评分≥80 分，且至少对 1 种靶标病害防效≥60%、1 项促生指标≥25% 的菌株，即为“高效防病促生皮尔瑞俄类芽胞杆菌菌株”。

 

六、关键注意事项

 

多生境采样：至少采集 5-10 个不同生境的样品，增加菌株多样性，提高筛选到“高效菌株”的概率；

 

多靶点筛选：防病需覆盖“细菌 + 真菌”类病原菌，促生需检测“产 IAA + 固氮 / 溶磷”，避免菌株功能单一；

 

结合实际应用场景：若目标是“低温地区农田”，需强化菌株的低温生长能力（5-15）筛选；若用于“盐碱地”，需提高耐盐（≥3% NaCl）筛选标准；

 

分子辅助筛选：可通过 PCR 扩增“抑菌基因（如脂肽合成基因fenD）”或“促生基因”，快速预判菌株功能，缩短筛选周期。

 

通过以上流程，可系统性筛选出兼具“高效性、稳定性、实用性”的皮尔瑞俄类芽胞杆菌菌株，为后续农业应用（如生物菌剂研发）提供核心菌种资源。

 

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