假单胞分离琼脂培养基的实验原理和使用方法及主要应用！

 

假单胞分离琼脂（Pseudomonas Isolation Agar, PIA）是一种选择性培养基，专门设计用于从含有多种微生物的样本（如临床样本、环境样本、食品等）中分离和初步鉴定假单胞菌属（Pseudomonas spp.），尤其是临床上重要的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）。

 

一、原理

 

PIA 的选择性和鉴别性主要基于以下关键成分：

 

溴化十六烷基三甲铵：

 

作用：这是培养基的核心选择性成分。CTAB 是一种季铵盐类阳离子表面活性剂/消毒剂。

 

机制：CTAB 能有效抑制大多数革兰氏阳性细菌和许多革兰氏阴性细菌的生长。它对细胞膜具有破坏作用。

 

选择性：假单胞菌属，特别是铜绿假单胞菌，对 CTAB 具有天然耐受性（主要是由于其外膜结构和主动外排泵机制），能够在含有 CTAB 的培养基上生长，而其他许多细菌则被抑制或杀死。

 

明胶：

 

作用：提供氮源和碳源，同时也是鉴别性成分。

 

机制：某些假单胞菌（如铜绿假单胞菌）能产生明胶酶（一种蛋白酶）。

 

鉴别性：在培养后，将平板（或取出部分菌落）浸入酸性汞试剂中。如果细菌水解了明胶，培养基中原本不溶性的明胶被分解，导致培养基在试剂作用下出现清晰的透明晕圈（水解区）围绕在菌落周围。未水解明胶的区域则呈现浑浊或不透明。这是鉴定铜绿假单胞菌的一个重要特征（通常阳性）。

 

甘油：

 

作用：主要作为可发酵的碳源。

 

机制：假单胞菌属通常不能发酵糖类产酸，但它们可以利用甘油进行氧化代谢。虽然PIA不直接用于观察酸产生（不像一些含指示剂的培养基），但甘油提供能量支持其生长。

 

氯化钾：

 

作用：提供钾离子，可能有助于增强CTAB的抑制效果或优化渗透压。

 

硫酸镁：

 

作用：提供镁离子，是许多酶促反应必需的辅助因子，促进假单胞菌生长和色素的产生。

 

琼脂：固化剂。

 

总结原理：CTAB 抑制了绝大多数非假单胞菌的细菌，允许耐受的假单胞菌生长。明胶水解试验（需要额外试剂处理）可用于初步区分能产生明胶酶的假单胞菌（如铜绿假单胞菌）与其他可能耐受CTAB但明胶酶阴性的细菌。此外，铜绿假单胞菌在PIA上通常会产生特征性的色素（蓝绿色的绿脓菌素和/或黄绿色的荧光素，在紫外灯下观察荧光更明显），这也是重要的鉴定线索。

 

二、使用方法

 

培养基制备：

 

根据制造商说明称取规定量的PIA干粉。

 

加入适量蒸馏水或去离子水，搅拌混匀。

 

加热煮沸使其完全溶解。

 

分装到适当的容器（如试管或三角瓶）。

 

高压灭菌：121°C (15 psi) 灭菌15分钟。

 

倒平板：待培养基冷却至约45-50°C（不烫手但尚未凝固），在无菌条件下将其倒入无菌培养皿中（通常每皿约15-20ml）。

 

凝固与干燥：让平板在室温下完全凝固。使用前最好将盖子微开，在生物安全柜或烘箱中（约35-37°C）放置短时间（15-30分钟）以去除表面冷凝水（但避免过度干燥）。

 

样本接种：

 

根据样本类型（如痰液、脓液、伤口拭子、水样、食品匀液等）进行适当的前处理（如均质化、稀释）。

 

划线分离：使用标准的平板划线分离技术（如四区划线法）将样本接种到PIA平板上。目的是获得单个分离的菌落。

 

点种：如果已有纯培养或可疑菌落，也可点种到PIA上进行验证。

 

培养：

 

温度：将接种好的平板倒置（防止冷凝水滴落）放入培养箱。

 

主要温度：35-37°C（用于一般分离）。

 

关键温度（提高选择性）：对于特别要求高选择性（如抑制其他耐CTAB的非假单胞菌）或针对铜绿假单胞菌，42°C培养是强烈推荐甚至必需的。铜绿假单胞菌能在42°C生长良好，而许多其他细菌（包括一些假单胞菌）则不能。

 

时间：培养 18-24小时通常足够观察结果。如果24小时后生长稀少或未观察到特征色素，可延长培养至48小时（铜绿假单胞菌的色素产生有时需要更长时间）。

 

结果判读：

 

生长观察：检查平板上是否有细菌生长。在CTAB存在下生长的菌落高度提示假单胞菌属。

 

色素观察：

 

在白光下观察菌落颜色。铜绿假单胞菌常产生蓝绿色（绿脓菌素） 和/或黄绿色（荧光素） 的扩散性色素。色素可能渗入培养基中。有些菌株可能只产生一种色素或不产生。

 

在紫外灯（长波，~366nm） 下观察。铜绿假单胞菌产生的荧光素会发出黄绿色荧光。这是非常有价值的鉴定特征。

 

明胶水解试验（需要额外步骤）：

 

方法一（平板直接法）：向培养好的平板表面倾注足量的Frazier’s明胶水解试剂（含HgCl的酸性溶液），覆盖整个表面，静置约10-20分钟。倒掉多余试剂（按生物危害废物处理），观察平板。

 

方法二（菌落挑取法）：用无菌接种环挑取单个菌落，涂抹或穿刺接种到营养明胶培养基（如试管装）中，在35-37°C培养最多7天。每天观察或培养后将试管置4°C冰箱30分钟，检查明胶是否液化（不凝固）。

 

结果判读：菌落周围或下方出现清晰的透明区（水解圈），而培养基其他区域呈浑浊或不透明，即为明胶水解阳性。无透明区则为阴性。铜绿假单胞菌通常为阳性。

 

菌落形态：假单胞菌在PIA上的菌落通常较大、扁平、边缘不规则、扩散状、表面有光泽、湿润，有时呈粘液状。色素是其最显著特征。

 

三、应用与局限性

 

主要应用：

 

从混合菌群中选择性分离假单胞菌属。

 

初步鉴定铜绿假单胞菌（基于CTAB耐受、42°C生长、色素产生、明胶水解阳性）。

 

环境、食品、水及临床样本（特别是囊性纤维化患者呼吸道样本）中假单胞菌的检测。

 

局限性：

 

并非所有假单胞菌都对CTAB耐受（尽管主要致病种耐受）。

 

极少数非假单胞菌（如某些鞘氨醇单胞菌、伯克霍尔德菌、寡养单胞菌等）也可能耐受CTAB并在PIA上生长，尤其是在35-37°C时。42°C培养能显著减少这类假阳性。

 

色素产生不稳定：并非所有铜绿假单胞菌菌株都产生色素（尤其是临床分离株）。

 

明胶水解试验需要额外操作和试剂。

 

最终鉴定仍需结合革兰氏染色、氧化酶试验、生化试验或分子方法进行确认。

 

四、重要注意事项

 

CTAB具有刺激性，操作干粉和配制培养基时需佩戴手套、口罩和护目镜。

 

明胶水解试剂（含汞）有剧毒，操作需极其小心，在通风橱中进行，并按规定处理废液。

 

42°C培养是提高选择性和特异性（针对铜绿假单胞菌）的关键步骤。

 

培养后应尽快观察色素（特别是荧光），因为色素可能随时间扩散或降解。

 

菌落形态和色素是初步线索，必须通过进一步的鉴定试验来确认菌种。

 

总而言之，假单胞分离琼脂通过CTAB的强选择性抑制和明胶水解的鉴别性，结合色素观察和温度控制（42°C），是实验室分离和初步鉴定假单胞菌属，特别是铜绿假单胞菌的有力工具。

 

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