加载中…血球计数板的几个问题
(2017-11-22 08:50:30)
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血球计数板 |
分类： 【A-教材研究】 |
关于血球计数板
“培养液中酵母菌种群数量的变化”属于一项探究实验，旨在培养学生建构种群增长的数学模型，并用数学模型解释种群数量变化的能力，具有多方面的意义和价值。但这项探究历时长，涉及的技术多而复杂，教科书通常仅作简要的提示，因此具体实施过程中需要教师提供或师生共同查阅相关资料，如血球计数板的使用就是学生学习中不容回避的障碍之一。因此对血球计数板的原理和使用办法做一梳理和归纳。
一、关于使用原理
显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数，然后推算出含菌数的一种方法。血球计数板是常用的计菌器之一。
血球计数板是一种专门用于计算较大单细胞微生物的一种仪器，由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室。
1 规格
九个大方格的每个长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其容积为0.1mm3，即1mm×1mm×0.1mm方格的计数板；大方格的长和宽各2mm，深度为0.1mm，其容积为0.4mm3，即2mm×2mm×0.1mm方格的计数板。在血球计数板上，刻有一些符号和数字(见图一)，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25个中格；0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示计数室面积是1mm2，分400个小格，每小格面积是1/400
mm2。
关于探究活动中血球计数板的选用，人教版、浙科版教材推荐使用2mm×2mm方格，苏教版推荐使用1mm×1mm方格。后者在市场上较为常见，多数大学教材也多以此规格为例。以上数据是指计数板计数平台上大方格的规格，也即计数室的边长。由于方格网距盖玻片0.1mm，因此，这两种计数室的容积分别为0.4mm3(4×10-4mL)、0.1mm3(1×10-4mL)。
当镜检所选中格并计数完毕后，推算出整个计数室细胞总数，除以计数室容积就可获得所测培养液中酵母菌的种群密度。
2
计算公式(以1mm×1mm规格计数板为例)
2.1
用25×16型计数室计数
通常计数四个角及中央的五个中方格(5×16=80个小方格)的细胞数A，计数重复3次，取平均值。计算公式为：
酵母菌个数/1mL=80个小方格细胞总数/80×400×10000×稀释倍数；
或：=A/5×25×10000×稀释倍数。
2.2
用16×25型计数室计数
通常计数四个角的中方格(4×25=100个小方格)的细胞数A＇，计数重复3次，取平均值。
计算公式为：酵母菌个数/1mL=100个小方格细胞总数/100×400×10000×稀释倍数；或：=A＇/4×16×10000×稀释倍数。
公式中，“10000”是指1mL相当于10000个计数室(容积为0.1mm3)的容积。
因为：1mL=1cm3=1000mm3，0.1mm3=1×10-4mL。
“10000"前面的式子表示计数室中细胞总数，可用小方格数400×平均每个小方格中细胞数，也可用计数室所含中方格数×平均每个中方格中细胞数。综上所述，计算公式可概括为：酵母菌个数/1mL=计数室中酵母菌数×10000×稀释倍数，其中计数室中酵母菌数因其规格及取样方法而异。
3
边缘效应的计数问题
对于压在方格界线上的酵母菌应当计数同侧相邻两边上的菌体数，人教版教师教学用书必修三2007年版第75页明确描述为：“一般而言，样方顶边、左边及左角处的个体统计在内，其他边缘不作统计。”浙江科学技术出版社教科书必修三2004年版第72页描述为：“压在方格线上的细胞只计左线和上线上的细胞数”。河北少儿版第82页也有类似的描述，但还常见到以下不同说法：2010年版教辅资料《世纪金榜》第42页描述为：“对于压在小方格界线上的酵母菌，应只计数相邻两边及其顶角的酵母菌。”
1989年第二版高等学校教材《微生物学实验》第137页则描述为：“位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。”
综上所述，鉴于中学阶段教学实际及操作的可行性和避免混乱，建议采用人教版教学用书的处理约定。在计数时一般可遵循“计上不计下，计左不计右”的原则处理，另两边不计数，交点处个体只记一次。
如果使用16格×25格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数；如果规格为25格×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。
二、几个使用注意事项
《培养液中酵母菌种群数量的动态变化》实验是一个历时较长（7天左右）的实验，事前一定要做好周密的计划，定程序、定时间、定人员。每天采用抽样检测法使用血球计数板对酵母菌进行计数，在计数时应从以下几方面注意。
1．每天同一时间，各组取出本组的试管，用血球计数板计数酵母菌个数，并作记录，连续观察7天。
2．从试管中吸出培养液进行计数之前，要将试管轻轻震荡几下，这样使酵母菌分布均匀，防止酵母凝聚沉淀，提高计数的代表性和准确性，求得的培养液中的酵母菌数量误差小。
3．如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应当对培养液进行稀释以便于酵母菌的计数。具体方法是：摇匀试管，取1mL酵母菌培养液，加入成倍的无菌水稀释，稀释n倍后，再用血球计数板计数，所得数值乘以稀释倍数。以每小方格内含有4—5个酵母细胞为宜。特别是在培养后期的样液需要稀释后计数。
4．活酵母有芽殖现象，若芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为两个菌体计数，若芽体小于母细胞一半时为1个酵母细胞。
5．计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算，对每个样品可计数三次，再取其平均值。计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体。按公式计算每1ml（或10mL）菌液中所含的酵母菌个数。
6．加样：因血球计数板在结构及原理上不同于普通的载玻片，其加样及盖盖玻片也有特殊要求，即“先将盖玻片放在计数室上，用吸管吸取培养液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行渗入，多余的培养液用滤纸吸去”。(人教版教科书必修三2007年版P68)。河北少儿版第82页描述为：“从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片下缘滴入一小滴(勿产生气泡)，用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液”。而浙科版第72页却描述为：“用滴管从试管中取1滴培养液到血细胞计数板的方格区，盖上盖玻片。”
7．血球计数板的清洁：血球计数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。
8．关于盖盖玻片：网络中部分实验视频中也采取了后盖盖玻片的方式。其实，后盖盖玻片也未尝不可，但它对液滴量的要求较高，盖盖玻片时也易产生气泡。因此，从操作规范及成功率角度讲，应采用先盖盖玻的方式。至于加样位置，因计数室靠外侧边缘的平台已作斜面处理(如图1)，这使得在盖玻片(图中最上层虚线框)边缘处与计数室所在平台的距离大于0.1mm，就是为了方便液滴自行吸入，因此，图1中箭头所示部位为最佳加样位置。待液体充满计数室所在平台，立即撤走吸管，一般不会有过多的液体流入沟槽。相反地，若从沟槽内沿盖盖玻片下缘滴入，不易操作且易导致液滴流入沟槽。因此建议采用人教版所述流程操作。适量加样之后，从侧面观察应如图2所示状态。
但不少教辅资料如及一些介绍其用法的文章常将侧面图表示为图3状态，若如此，则意味着培养液已因过多而溢入沟槽，这是不符合操作规范的。
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