由于新浪博客规定，每篇文章不可超过2万字符，因此分4篇发布。

一、使用GATK前须知事项：

（1）对GATK的测试主要使用的是人类全基因组和外显子组的测序数据，而且全部是基于illumina数据格式，目前还没有提供其他格式文件（如Ion Torrent）或者实验设计（RNA-Seq）的分析方法。

（2）GATK是一个应用于前沿科学研究的软件，不断在更新和修正，因此，在使用GATK进行变异检测时，最好是下载最新的版本，目前的版本是2.8.1（2014-02-25）。下载网站：http://www.broadinstitute.org/gatk/download。

（3）在GATK使用过程中（见下面图），有些步骤需要用到已知变异信息，对于这些已知变异，GATK只提供了人类的已知变异信息，可以在GATK的FTP站点下载（GATK resource bundle）。如果要研究的不是人类基因组，需要自行构建已知变异，GATK提供了详细的构建方法。

（4）GATK在进行BQSR和VQSR的过程中会使用到R软件绘制一些图，因此，在运行GATK之前最好先检查一下是否正确安装了R和所需要的包，所需要的包大概包括ggplot2、gplots、bitops、caTools、colorspace、gdata、gsalib、reshape、RColorBrewer等。如果画图时出现错误，会提示需要安装的包的名称。

 

二、GATK的使用流程

http://s13/mw690/005waXhyzy6H0V0dkVC3c&690

GATK最佳使用方案：共3大步骤。原始数据的处理—变异检测—初步分析。

 

第一大步：原始数据的处理

 

1. 对原始下机fastq文件进行过滤和比对（mapping）

对于Illumina下机数据推荐使用bwa进行mapping。

 

Bwa比对步骤大致如下：

（1）对参考基因组构建索引：

     例子：bwa index -a bwtsw hg19.fa。最后生成文件：hg19.fa.amb、hg19.fa.ann、hg19.fa.bwt、hg19.fa.pac和hg19.fa.sa。

     构建索引时需要注意的问题：bwa构建索引有两种算法，两种算法都是基于BWT的，这两种算法通过参数-a is 和-a bwtsw进行选择。其中-a bwtsw对于短的参考序列是不工作的，必须要大于等于10Mb；-a is是默认参数，这个参数不适用于大的参考序列，必须要小于等于2G。

（2）寻找输入reads文件的SA坐标。

     对于pair end数据，每个reads文件单独做运算，single end数据就不用说了，只有一个文件。

     例子：pair end：

bwa  aln  hg19.fa  read1.fq.gz  -l 30  -k 2  -t 4  -I  > read1.fq.gz.sai

bwa  aln  hg19.fa  read2.fq.gz  -l 30  -k 2  -t 4  -I  > read2.fq.gz.sai

single end：

bwa  aln  hg19.fa  read.fq.gz  -l 30  -k 2  -t 4  -I  > read.fq.gz.sai

主要参数说明：

-o int：允许出现的最大gap数。

-e int：每个gap允许的最大长度。

-d int：不允许在3’端出现大于多少bp的deletion。

-i int：不允许在reads两端出现大于多少bp的indel。

-l int：Read前多少个碱基作为seed，如果设置的seed大于read长度，将无法继续，最

好设置在25-35，与-k 2 配合使用。

-k int：在seed中的最大编辑距离，使用默认2，与-l配合使用。

-t int：要使用的线程数。

-R int：此参数只应用于pair end中，当没有出现大于此值的最佳比对结果时，将会降低标

准再次进行比对。增加这个值可以提高配对比对的准确率，但是同时会消耗更长的

时间，默认是32。

-I int：表示输入的文件格式为Illumina 1.3+数据格式。

-B int：设置标记序列。从5’端开始多少个碱基作为标记序列，当-B为正值时，在比对之

前会将每个read的标记序列剪切，并将此标记序列表示在BC SAM 标签里，对于

pair end数据，两端的标记序列会被连接。

-b ：指定输入格式为bam格式。bwa  aln  hg19.fa  read.bam  > read.fq.gz.sai

 

（3）生成sam格式的比对文件。如果一条read比对到多个位置，会随机选择一种。

     例子：single end：bwa  samse  hg19.fa  read.fq.gz.sai  read.fq.gz  > read.fq.gz.sam

           参数：-n int：如果reads比对次数超过多少次，就不在XA标签显示。

                 -r str：定义头文件。‘@RG\tID:foo\tSM:bar’，如果在此步骤不进行头文件定义，在

后续GATK分析中还是需要重新增加头文件。

           pair end：bwa sampe -a 500 read1.fq.gz.sai read2.fq.gz.sai read1.fq.gz read2.fq.gz > read.sam

           参数：-a int：最大插入片段大小。

                 -o int：pair end两reads中其中之一所允许配对的最大次数，超过该次数，将被视为

single end。降低这个参数，可以加快运算速度，对于少于30bp的read，建

议降低-o值。

                 -r str：定义头文件。同single end。

                 -n int：每对reads输出到结果中的最多比对数。

 

对于最后得到的sam文件，将比对上的结果提取出来（awk即可处理），即可直接用于GATK的分析。

注意：由于GATK在下游的snpcalling时，是按染色体进行callsnp的。因此，在准备原始sam文件时，可以先按染色体将文件分开，这样会提高运行速度。但是当数据量不足时，可能会影响后续的VQSR分析，这是需要注意的。

 

2. 对sam文件进行进行重新排序（reorder）

由BWA生成的sam文件时按字典式排序法进行的排序（lexicographically）进行排序的（chr10，chr11…chr19，chr1，chr20…chr22，chr2，chr3…chrM，chrX，chrY），但是GATK在进行callsnp的时候是按照染色体组型（karyotypic）进行的（chrM，chr1，chr2…chr22，chrX，chrY），因此要对原始sam文件进行reorder。可以使用picard-tools中的ReorderSam完成。

e.g．

java -jar picard-tools-1.96/ReorderSam.jar

I=hg19.sam

O=hg19.reorder_00.sam

REFERENCE=hg19.fa

 

注意：

1. 这一步的头文件可以人工加上，同时要确保头文件中有的序号在下面序列中也有对应的。虽然在GATK网站上的说明chrM可以在最前也可以在最后，但是当把chrM放在最后时可能会出错。

2. 在进行排序之前，要先构建参考序列的索引。

   e.g. samtools faidx hg19.fa。最后生成的索引文件：hg19.fa.fai。

3. 如果在上一步想把大文件切分成小文件的时候，头文件可以自己手工加上，之后运行这一步就好了。

 

 

3. 将sam文件转换成bam文件（bam是二进制文件，运算速度快）

这一步可使用samtools view完成。

e.g. samtools view -bS hg19.reorder_00.sam -o hg19.sam_01.bam

 

4. 对bam文件进行sort排序处理

这一步是将sam文件中同一染色体对应的条目按照坐标顺序从小到大进行排序。可以使用picard-tools中SortSam完成。

e.g.

java -jar picard-tools-1.96/SortSam.jar

INPUT=hg19.sam_01.bam

OUTPUT=hg19.sam.sort_02.bam

SORT_ORDER=coordinate

 

5. 对bam文件进行加头（head）处理

GATK2.0以上版本将不再支持无头文件的变异检测。加头这一步可以在BWA比对的时候进行，通过-r参数的选择可以完成。如果在BWA比对期间没有选择-r参数，可以增加这一步骤。可使用picard-tools中AddOrReplaceReadGroups完成。

e.g.

java -jar picard-tools-1.96/AddOrReplaceReadGroups.jar

I=hg19.sam.sort_02.bam

O=hg19.reorder.sort.addhead_03.bam

ID=hg19ID

LB=hg19ID

PL=illumine

PU=hg19PU

SM=hg19

ID str：输入reads集ID号；LB：read集文库名；PL：测序平台（illunima或solid）；PU：测序平台下级单位名称（run的名称）；SM：样本名称。

注意：这一步尽量不要手动加头，本人尝试过多次手工加头，虽然看起来与软件加的头是一样的，但是程序却无法运行。

 

6. Merge

如果一个样本分为多个lane进行测序，那么在进行下一步之前可以将每个lane的bam文件合并。

e.g.

java -jar  picard-tools-1.70/MergeSamFiles.jar

INPUT=lane1.bam

INPUT=lane2.bam

INPUT=lane3.bam

INPUT=lane4.bam

……

INPUT=lane8.bam

OUTPUT=sample.bam

 

7. Duplicates Marking

在制备文库的过程中，由于PCR扩增过程中会存在一些偏差，也就是说有的序列会被过量扩增。这样，在比对的时候，这些过量扩增出来的完全相同的序列就会比对到基因组的相同位置。而这些过量扩增的reads并不是基因组自身固有序列，不能作为变异检测的证据，因此，要尽量去除这些由PCR扩增所形成的duplicates，这一步可以使用picard-tools来完成。去重复的过程是给这些序列设置一个flag以标志它们，方便GATK的识别。还可以设置 REMOVE_DUPLICATES=true 来丢弃duplicated序列。对于是否选择标记或者删除，对结果应该没有什么影响，GATK官方流程里面给出的例子是仅做标记不删除。这里定义的重复序列是这样的：如果两条reads具有相同的长度而且比对到了基因组的同一位置，那么就认为这样的reads是由PCR扩增而来，就会被GATK标记。

e.g.

java -jar picard-tools-1.96/MarkDuplicates.jar

REMOVE_DUPLICATES= false

MAX_FILE_HANDLES_FOR_READ_ENDS_MAP=8000

INPUT=hg19.reorder.sort.addhead_03.bam

OUTPUT=hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.bam METRICS_FILE=hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.metrics

注意： dedup这一步只要在library层面上进行就可以了，例如一个sample如果建了多个库的话，对每个库进行dedup即可，不需要把所有库合成一个sample再进行dedup操作。其实并不能准确的定义被mask的reads到底是不是duplicates，重复序列的程度与测序深度和文库类型都有关系。最主要目的就是尽量减小文库构建时引入文库的PCR bias。

 

8. 要对上一步得到的结果生成索引文件

可以用samtools完成，生成的索引后缀是bai。

e.g.

samtools index hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.bam

 

作者：葡萄糖

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