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唐明智
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测序

DNA

峰图

引物

碱基

序列

杂谈

分类: 测序常见问题分析

在测序过程中,引物质量是影响测序结果的一个重要因素,由于载体测序通常使用的是载体上的通用引物,而且是由测序公司提供,因此一般不会出现问题。而 PCR产物测序使用的是个人自己设计并合成的引物,引物的质量差别很大,因此有时会出现问题。

1.引物降解

 原因:引物保存不好会导致引物降解,用来测序时会导致该引物扩增出来的产物梯度性的相差一个碱基,

 峰图特征:在峰图上表现为

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分类: 业界观察

Solexa 高通量测序原理 

Solexa 方法是利用单分子阵列测试 genotyping ,此种测序法首先是 将 DNA 从细胞中提取,然后将其打断到约 100 - 200bp 大小,再将接头连接到片段上,经 PCR 扩增后制成 Library 。随后在 含有接头的芯片( flow cell )上将已加入接头的 DNA 片段绑定在 flow cell 上,经反

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DNA

测序

峰图

序列

克隆

碱基

缺失

杂谈

分类: 测序常见问题分析

碱基缺失其实是双模板的一种特殊形态,某一样品在某一碱基后包含两类片段,其中一条片段比另一条片段少(或多)几bp或几十bp,因此在峰图上表现为从某处开始为两个峰的叠加,碱基缺失多发生在PCR测序中,并在峰图上表现出一定的规律。

1.单碱基缺失

 

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DNA

测序

峰图

poly

结构

杂谈

分类: 测序常见问题分析

PolyA/T结构通常致其后的峰图出现重叠峰,PolyG/C 结构通常致其后的峰图出现信号衰减。Poly结构是导致测序失败最常见的原因之一,目前还没有非常有效的方法彻底解决Poly结构的影响,但一般而言,PCR样品Poly结构后双峰的概率非常高,而菌液中Poly结构对测序结果的影响较少或没有。

解决办法:

 

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测序

序列

峰图

载体

克隆

DNA

杂谈

分类: 测序常见问题分析

测序过程中最常见的问题是双峰,导致整个结果不可用,有时候我们也纳闷,明明挑的是单克隆,为什么还会碰到双峰呢?其实导致双峰的原因是多种的,双克隆只是其中的一原因,而且不同的起因在峰图上表现出不同的特征,通过对峰图的分析找出双峰的起因是解决问题最直接的方法。

1.双克隆(连接到载体测序)

特征:

峰图上最显著的特征是前几十bp

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dnastar

测序

载体

序列

峰图

杂谈

分类: 生物软件的使用

插入到载体上的片段在分析前需要先去除载体序列,而Seqman 提供了自动去除载体的功能,你只需选择你的载体类型即可,点击图中的下拉框即可看到软件自带的载体文件

 

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dnastar

测序

序列拼接

峰图

杂谈

分类: 生物软件的使用
启动Seqman,点击面板中的Add sequence 按钮添加将要拼接的序列

选中目标序列,点击Add--Done导入目标序列

DNAstar 软件的使用(三)Seqman拼接序列 - 唐明智 - 唐明智的博客 

如果导入的是峰图文件,可以双击文件名会弹出峰形图,通过移动黑色的分隔线可以去除测序质量不高的区域(黄色区域),从而避免在拼接过程中产生模棱两可的数据。

DNAstar 软件的使用(三)Seqman拼接序列 - 唐明智 - 唐明智的博客
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dna

dnastar

测序

序列

引物

杂谈

分类: 生物软件的使用

Editseq 软件的功能

Editseq 软件默认可打开seq,pro格式的文件,但也可以打开abi,TXT,FAS格式的文件,从而实现各种格式的相互转换。

DNAstar 软件的使用(二)Editseq 软件的功能 - 唐明智 - 唐明智的博客

 

Editseq 软件具有查找ORF和目标序列(引物序列)的功能,点击Search---Find会弹出一个对话框,粘贴入目标序列即可.引物查找可选择精确查找和模糊查找,建议模糊查找,以避免因单个碱基匹配不上从而查找不到序列的情况

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dnastar

序列比对

dna

测序

相似性

杂谈

分类: 生物软件的使用
DNAstar软件共有七个小程序(见下图),各自执行不同的功能,Editseq用于序列编辑,Seqman可以去除载体序列和拼接序列,MegAlign则主要执行序列比对的功能.


 开启MegAlign软件首先需要点击File---New 新建一个工作文件


 

再点击File---Entersequeces 添加需要比对的序列,支持多种格式的文件(.seq;.abi;.pro;.fas

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